[发明专利]丝状体蓝藻高效表达盒和含有该表达盒的载体

说明书

本发明涉及一种丝状体蓝藻高效表达盒和含有该表达盒的载体。

近几年来，以蓝藻为宿主的基因工程发展迅速。蓝藻又名蓝细菌，是一类光合原核生物。蓝藻的遗传特性决定了蓝藻基因工程的进展。蓝藻的结构与大肠杆菌的分子遗传背景十分相似。而且蓝藻中除染色体DNA外，还含有质粒DNA，也能发生接合和转化。这使它们易于进行分子操作，成为至今在藻类中唯一能成功地转入和表达外源基因的类群。这些都使蓝藻的分子生物学和基因工程近15年来得到了较快的发展，蓝藻已经成为基因工程的有效工具。

1981年Kuhlemeier等首次把抗生素基因导入蓝藻。1994年日本和我国学者同时把药物基因转入了蓝藻。这以后，我们研究集体再把人肿瘤坏死因子-α、尿激酶原、人表皮生长因子、人小肠三叶因子等基因转入到蓝藻并成功地表达，主要用于制药和处理环境。

虽然转基因蓝藻已有希望产业化制备药物或处理环境，但存在一个极需解决的问题就是提高表达效率以加速产业化进程。迄今为止，国内外所报导的蓝藻表达外源基因的表达效率都不高。与大肠杆菌相比差1-2个数量级。

我们研究集体近几年也对转基因蓝藻中外源基因的表达效率进行了探索。从1993年起，我们先后通过改变载体质粒(穿梭表达载体和整合表达载体)、启动子(PpsbA和金属诱导型启动子)、受体等因素，表达效率有所提高，但仍不理想。

由于蓝藻是原核生物，其转录和翻译几乎同时进行。近几年对适用于蓝藻基因工程的启动子研究较深入(如强启动子和诱导型启动子的应用)，但对翻译水平的调控研究不多。外源基因的高效表达不仅和转录起始频率有关，在很大程度上也与mRNA的翻译起始频率密切相关。在大肠杆菌中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。翻译水平调控的研究主要涉及SD序列和起始密码子、偏爱密码子。人工合成引入适用于蓝藻的SD序列(6～8个碱基左右)，是一条有效可行的途径。

mRNA的翻译起始频率主要由其5’-末端的结构序列决定，称为核糖体结合位点(RBS)。RBS主要包括以下四个要素：(1)位于mRNA上翻译起始密码上游的富含嘌呤结构、可与核糖体16sRNA末端结合的SD序列(Schine-Delgarno)；(2)起始密码子：在E.coli和蓝藻中，较常用的是AUG，也有少数使用GUG.；(3)SD与起始密码子间的碱基组成和距离；(4)起始密码子后的核苷酸序列对核糖体结合的影响。

针对目前存在的表达效率不高的问题和调控的可能性，本发明在原来我们实验室已构建的pDC-TNF载体基础工作上作了如下三方面改进：(1)通过PCR方法在目的基因TNF-α之前连上适用于蓝藻的SD序列，(2)缩短了启动子PpsbA与目的基因之间的距离；(3)调整SD序列与目的基因TNF-α之间的距离来提高TNF-α的表达效率。

本发明的一个目的是提供一种用于在丝状体蓝藻中高效表达外源基因的表达盒。

本发明的另一个目的是提供一种丝状体蓝藻高效表达载体。

因而，本发明提供了一种用于在丝状体蓝藻中高效表达外源基因的表达盒，包括启动子，SD序列和目的基因，其中所述的SD序列为5’-GGAGAG-3’。所述的启动子可以是可以在丝状体蓝藻中表达外源基因的任何一种启动子，例如PpsbA。

本发明的表达盒中，所述的外源基因可以为人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因，也可以为其它的外源基因。

在本发明的表达盒中，SD序列与目的基因起始密码子之间的距离为4bp。

在本发明的表达盒中，启动子与目的基因之间的距离为19bp。

本发明还提供了一种丝状体蓝藻表达载体，其特征在于，该载体含有本发明的表达盒。所述的载体可以是任何一种已知的在丝状体蓝藻中表达外源基因的质粒载体，例如pKT-210，pDC-08，pRL-489。

本发明利用质粒pIB-Tc构建了一种丝状蓝藻的高效表达载体pIB-TNFα，并将这种表达载体在中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏中心地址：中国，北京，中关村。保藏号为：CGMCCNo.0508。

在本发明的表达盒中，从SD序列到起始密码子的序列最好是GGAGAGTCATATG。

用新的SD序列构建成pIB-TNF的表达效率提高了7倍，如表2所示