[发明专利]人Neurturin结构类似物多肽、其编码序列及其制备方法

说明书

本发明涉及一种人Neurturin结构类似物多肽，其与天然人Neurturin相比，N-末端缺失了2-6个氨基酸。本发明还涉及编码所述人Neurturin结构类似物多肽的多核苷酸，含有所述多核苷酸的表达载体，用该表达载体转化的大肠杆菌，以及生产所述人Neurturin结构类似物多肽的方法。

本领域公知的是，在大肠杆菌中表达异源蛋白常遇到表达量低和形成不溶性包涵体的问题。采用表达融合蛋白的策略(如与TrxA,GST等融合)、降低温度等方法虽可部分解决问题，但很多情况下，基因本身的编码序列对表达的影响更显著。在原核生物中，由于不同的tRNA在含量上的差异很大，产生了对密码子的偏爱性，从而影响了基因的表达，特别是靠近起始密码区稀有密码子的聚集对表达的抑制更严重(Hu等，蛋白质表达与纯化，7,289-293,1996)。另外研究表明在成熟蛋白N末端存在精氨酸时常会影响其表达和穿过内膜的功能(Andersson等，FEBS通信，347,169-172,1994)。

Neurturin(NTN)是1996年底新发现的神经营养因子，其成熟肽与GDNF有42％的同源性，它们共同组成了TGF-β超家族的一个亚家族。NTN对多巴胺能神经元、运动神经元及外周神经系统的各类交感神经元、感觉神经元等都有很强的营养作用和损伤修复作用，为帕金森病及肌萎缩侧索硬化症(ALS)等神经退行性疾病和神经损伤疾病的治疗开辟了新的途径。由于这些因子在体内含量甚微，提取困难，造价昂贵，利用E.coli来生产，具有低成本、高效率、短周期的特点，已越来越成为人们研究的热门领域。但是已有的实践表明，人Neurturin蛋白在原核系统的表达不是令人满意，究其原因，可能是由于人Neurturin基因5′端有多个稀有密码子聚集，且第二个氨基酸为精氨酸。因此，本发明人由此入手，通过缺失和突变编码人Neurturin基因的5′端序列而在体外高效表达和制备具有Neurturin活性的人Neurturin结构类似物多肽，因而具有重要的理论意义和临床应用价值。

因此，本发明的目的在于提供一种编码人Neurturin结构类似物多肽的DNA序列，该DNA序列能在原核系统如大肠杆菌中高产量表达。

本发明的再一目的在于提供所述的人Neurturin结构类似物多肽

本发明的又一目的在于提供生产人Neurturin结构类似物多肽的方法。

根据本发明的一个方面，本发明提供了编码人Neurturin结构类似物多肽的DNA序列，其特征在于，其表达产物与天然人Neurturin相比，N-末端缺失了2-6个氨基酸，并且在不改变所编码的氨基酸组成的前提下，该多核苷酸的5′端有4个密码子突变为4个大肠杆菌嗜用的密码子。在本发明的一个实施方案中，本发明的DNA序列如SEQ ID NO:1中的核苷酸序列所示。在SEQ ID NO:1中，编码人Neurturin蛋白的N-末端头两个氨基酸Ala和Arg的两个密码子被缺失(在SEQ ID NO:1以横线示出)，另外，编码人Neurturin蛋白的N-末端第3、4、6和9位氨基酸的密码子被突变为大肠杆菌嗜用的密码子，突变涉及T→C,G→T,G→T,G→C的突变(在SEQID NO:1中以斜体示出)。本发明的DNA序列可掺入任何已知的原核表达载体，从而在原核系统特别是大肠杆菌中高效表达。例如，在本发明的一个实施方案中，本发明的DNA序列掺入表达载体pHM39(本发明人构建，其图谱见图1)中，构建成重组表达载体pHM39-NTNLM，然后用该重组表达载体转化大肠杆菌菌株HB101。由此得到的转化菌株命名为HB101-NTNLM，其于1999年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0421。另外，为促进对表达产物的纯化，本发明的多核苷酸可与例如六组氨酸标记序列融合，以利于用金属螯合亲和层析法对表达产物进行纯化。本发明的DNA序列也可与硫氧还蛋白编码基因或pelB基因融合以提高表达产量及产物的可溶性。

本发明的另一方面涉及利用大肠杆菌细胞制备人Neurturin结构类似物多肽的方法，所述的方法包括将本发明的DNA序列克隆到原核表达载体中，以重组表达载体转化大肠杆菌，最后分离纯化表达的人Neurturin结构类似物多肽。如此获得的产物的表达量占菌体总蛋白的5-30％，其中可溶性表达占20-40％，天然NTN蛋白则没有可溶性表达。并且所表达的人Neurturin结构类似物多肽经纯化后具有完好的生物学活性(见实施例部分)。