[发明专利]一种乙酰短杆菌及以该菌种为酶源制备5－氟尿苷的方法

说明书

本发明属于生化工程领域，涉及一种乙酰短杆菌及应用乙酰短杆菌制备5-氟尿苷的方法。

5-氟尿苷的化学名为1-β-D-呋喃核糖基-5-氟尿嘧啶，其结构式如下所示：

5-氟尿苷是一种重要的5-氟尿嘧啶衍生物，可以制备多种抗癌抗病毒药，如抗癌良药5-脱氧-5-氟尿苷(英文名为5’-deoxy-5-fluorouridine，氟铁龙)及2’-脱氧-5-氟尿苷即以5-氟尿苷为起始原料。

5-氟尿苷的制备方法从一般而言有化学合成法、发酵法和酶法。化学合成法有多种途径，较有代表性的有以下两种方法：

以5-氟尿嘧啶和核糖为原料：5-氟尿嘧啶2、4位首先硅烷化，制备成三甲基硅烷基-5-氟尿嘧啶(A)；而核糖则首先制备成四乙酰核糖(B)。(A)和(B)用路易斯酸作催化剂进行反应，得到酰化的5-氟尿苷，再水解可获得5-氟尿苷；

尿苷直接氟化：尿苷首先制成三乙酰化尿苷，然后在溶剂中用氟气处理，形成中间产物，6-乙酰基-三乙酰-5、6-双氢尿苷，再在甲醇或甲醇钠中用Et3N先脱去6位的保护剂，再脱去核糖上的保护基，从而获得5-氟尿苷。

上述方法需要用到昂贵的试剂及许多有机溶剂，对反应物的活性基团要进行保护和去保护，前者缩合反应选择性不高，有α-体产生，后者需要氟气，将造成环境污染。而近年来兴起的发酵法和酶法制备5-氟尿苷只需一步反应，不需要对某些基团保护或脱保护，缩合反应只产生β-体，并且还具有反应条件温和、不需要有毒有害的有机溶剂、环境污染小等优点，因此受到了人们的广泛重视。

发酵法合成5-氟尿苷是利用枯草芽孢杆菌ATCC19062进行生产的，该方法在30℃下培养68小时后，添加5-氟尿嘧啶2mg/mL，52小时后，5-氟尿苷的含量仅为2.5mg/mL，因反应时间长，容易染菌而无实用价值。

许多专利和文献公开了酶法制备5-氟尿苷的生产工艺。早期人们在研究5-FU抗癌机理时发现，癌细胞中尿苷磷酸化酶含量较高，可由5-氟尿嘧啶(简称5-FU)和核糖-1-磷酸可逆合成5-FUR，并用肿瘤细胞抽提物为酶源合成得到了5-FUR。日本专利：JP81102794采用Klebsiella pneumoniae ATCC9621为酶源，反应液配比为：

尿苷         1

KH₂PO₄     0.85

5-FU         0.2

60℃反应5小时，得到5-FUR，含量为155mg/dL，转化率仅为38％(对5-FUR)；

文献：Biosci.Biotech.Biochem 1992；56(4)：580-582在研究制备5-甲基尿苷时也合成获得了5-FUR。该方法虽然有较高的转化率(可达90％以上)，但由于存在需要添加多种酶制剂及反应浓度低等缺陷，因此，实用价值不高。

本发明的目的在于克服上述缺陷，提供一种乙酰短杆菌属(Brevibacteriumacetyicum)的菌种和以该乙酰短杆菌为酶源制备5-FUR的生产方法，该方法可以采用较高的底物浓度，使摩尔转化率最高可达60％，大大地降低了生产成本，能够满足医药工业的需要。

本发明的构思是这样的：采用乙酰短杆菌完整细胞制备5-FUR，主要是利用其产生的核苷磷酸化酶，即嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶，在微生物非增值情况下进行酶反应而生成5-FUR。

使用的微生物：

用于生产本发明所说的5-FUR的是一种属于乙酰短杆菌种的菌种，乙酰短杆菌(Brevibacterium acetyicum)QD96即为具有这种生产能力的菌种，以下简称QD96。该菌种与乙酰短杆菌ATCC954和乙酰短杆菌AT-6-7为同一种，对乙酰短杆菌ATCC954长期深冻，紫外线照射，γ射线辐射，化学试剂处理，(如硫酸二乙酯、亚硝酸、N-甲基-硝基-N-亚硝基胍等)，超声波等诱变处理，即可获得所说的乙酰短杆菌(Brevibacterium acetyicum)QD96。该菌种已于2000年7月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC No.0472。

QD96菌种具有如下性质：

1.形态特征：

(1)细胞的形态和大小：短杆状，0.8～1.0×1.0～1.2μm；

(2)胞子的形成：无；

(3)革兰氏染色性：阳性。

2.在各种培养基上的生长状态：

(1)牛肉浸膏琼脂平板培养(30℃，48小时)