[发明专利]高获得率提取替曲朵辛的方法

说明书

本发明涉及一种能以高获得率从河豚鱼内部组织(例如卵巢)中提取替曲朵辛的方法。

替曲朵辛属于小分子非蛋白的高活性神经毒素，主要存在于河豚鱼的卵巢、肝脏和血液中，其它部分含量极微。TTX也在其它动物甚至海藻中发现，包括蜥蜴，加州蝾螈，虎虾鱼，蓝环章鱼等。替曲朵辛化学名是：八氢-12-(羟甲基)-2-亚氨基-5，9：7，10 α-二甲桥-10αH-[1，3]二桥氧并[6，5-d]嘧啶-4，7，10，11，12-戊醇分子式：C₁₁H₁₇N₃0₈分子量：319.27其结构式为：TTX的结构特征是：仅有一个碳环，一个胍基，六个羟基和-个半醛糖内酯基团。纯的″替曲朵辛″是无色的结晶粉末。加热到220℃结晶变暗没有分解。″替曲朵辛″溶于酸性水溶液，不溶于水及有机溶剂：在水溶液中的Pka为8.76，属于碱性动物生物碱。在中性或有机酸性溶剂中对热相当稳定，在强酸和强碱性水溶液中迅速破坏。

用高压液相法分离、测定的天然河豚鱼中的毒素是含有10余种类似物的混合物，其中主要成分叫″替曲朵辛″它的含量在70％-80％之间。另外三种主要类似物为河豚酸、4一表替曲朵辛和脱水4一表替曲朵辛。这三个″替曲朵辛″的化学性质，有些微小的差别，但生物活性差别较大，例如它们的毒性，TTX的毒性为4500鼠单位/毫克，4-表替曲朵辛″的毒性仅为710鼠单位/毫克，而脱水4去4替曲朵辛″的毒性降低到92鼠单位/毫克(Toxicon，23 271-7276(1985))。

获取TTX的方法有2种，即人工合成和生物提取。1975年日本山口大学农业化学系的岸义人等人成功地合成了外消旋TTX。对TTX的生物提取始于本世纪初的1909年，日本人田原(J.pharm-soc.Japan 22 587(1909)，Biochem-z.30255，1911)用醋酸铅与氨水处理河豚鱼卵巢，得到了毒力为4.1γ(对1克小鼠平均极限致死量表示为MLD4.1γ/g，简写为4.1γ)的粗品，并将其命名为现在使用的″Tetrodotoxin″。在以后儿十年中，又出现了多种提取方法，有代表性的如：

横尾在1950年(日本化学杂志71 590，1950)用水浸取其卵巢，蒸干，得到于物质后，用醋酸铅与氨水使毒素共同沉淀，用磷钨酸，苦味酸汞除去不纯物，用苯肼除糖，再用苦味酸汞处理，最后依次用苦酮酸、甲醇、苦酮酸再处理，从20公斤卵巢中仅获得MLD0.8的结晶毒素13mg。

永井1951年(福冈医志经1(1954))第一次使用离子交换树脂AmberliteIRe-50吸附毒素，用盐酸洗脱，再用Amberlite IR-4B除去盐酸，浓缩后用无水乙醇提取毒素，最后从20公斤卵巢中得到MLD 0.008r的毒素结晶2.5mg。

1952年，津田与河村搞了一个用活性炭层析的大规模生产法(津田，化学的η领域，增刊，80 9(1967))，可以处理1000公斤卵巢并获得MLD 10μg/kg的毒素10克。在此同时，美国哈佛大学的Woodward(R.B.Woodward，Pure Appl.chem..9249-74(1964))也获得类似的结果。

1964年後藤俊夫等(後藤俊夫、高桥等，日本化学杂志85 508，1964)使用离子交换和活性炭吸附的提纯方法，从100公斤卵巢可以获得他们称的粗毒素1-2克，使得率有了明显的提高。其工艺流程见图1.。

1980年代后，陆续有学者报导了一些新的提取方法，迄今为止发表的提取方法不少于十几种，但得率并没有大的提高，仅为100公斤卵巢中提取TTX 1-2g。而本专利申请的提取方法，可以从100公斤卵巢中提取TTX 4-6g，得率高出已有方法的3倍。其工艺流程见图2.。

″替曲朵辛″(简称TTX)结晶品提取采用如图1所示工艺流程操作。

1.水浸取过程

取河豚鱼有毒性的卵巢数十公斤，绞碎为小于1厘米的碎块，放置于浸取一过滤装置中，加入1∶1.5的去离子水，为了使TTX更好地从卵巢中浸取出，加入卵巢重量0.1-1％的乙酸。开动搅拌，在室温搅拌数小时，停止搅拌，然后开动真空泵减压过滤，数分钟后，开动压缩机，让浸取一过滤装置上部压力达到0.5-1公斤/平方厘米。收集滤液，快速加热至70-95℃，加热时间3-25分钟，冷却后过滤出析出的蛋白，得黄色透明液体，称为第一次浸取清液。