[发明专利]EIA－特定药用化合物作为制备抗头颈部肿瘤药物的应用

说明书

本发明涉及一种基因与特定化学治疗药物联合应用以提高对头颈部肿瘤细胞杀伤能力的新方法。

大量临床研究资料已经证明，淋巴结转移和局部复发是影响头颈肿瘤患者预后最关键的因素。这是由于头颈部位重要器官密集，可切除范围有限，手术切缘中难免残存有癌细胞，且头颈部肿瘤易发生淋巴结转移所至。以局部治疗为主的手术和放射治疗措施对这些残存和转移的癌细胞疗效较差，加上头颈部肿瘤细胞对化疗药物又不敏感，导致约50％的患者终因复发、转移而死亡。长期以来，如何提高头颈肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，尽可能多地杀伤体内残存的肿瘤细胞，以提高疗效，一直是头颈肿瘤治疗中的难题。

腺病毒5型EIA基因(早期表达1区A基因)位于腺病毒基因组5′端，是一个具有抗癌作用的基因，长约1.7Kb。以往曾报导该基因具有抑制肿瘤生长的作用(Oncogene，1992，7：1255-1258)。另有报导：EIA基因能提高骨肉瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌细胞对顺铂和鬼臼乙叉甙(vp16)两种化疗药物的敏感性(Cancer Res，1995，55：5551-5555)。近年还有报导称EIA基因能提高HER-2/neu癌基因过度表达的乳腺癌细胞对化疗药紫杉醇的敏感性(Oncogene，1997，15：953-960)。但到目前为止，经检索，尚未见有EIA与相关化疗药物联合应用治疗头颈肿瘤的报导。

本发明之目的是针对目前头颈肿瘤治疗所面临的世界性难题，寻找常规手术和放射治疗之外新的有效方法，以期较大幅度提高头颈肿瘤的治疗效果。本发明的内容与要点：一真核高效表达EIA载体的构建及鉴定：

1、pCMV-EIA载体的构建：带有EIA全长基因的pUC119质粒和pBluescript M13质粒经EcoRI和BamHI酶切、电泳后，分别回收1.77kb全长EIA基因和2.96kb的pBluescript载体片段。T4连接酶12℃连接反应过夜，将产物转化JM109受体菌，用蓝白斑法筛选并鉴定出有EIA基因的阳性克隆，扩增并大量制备重组质粒。将此质粒和pcDNA3.1质粒用HindIII和Bam-HI酶切，电泳后回收1.77kb全长EIA和5.4kb的载体片段。用T4连接酶，12℃过夜，转化HB101受体菌，在含氨苄青霉素培养基的平皿上筛选出阳性克隆，并用HindIII和BamHI酶切鉴定。该表达载体除含有EIA本身的启动子外，还增加了较强的CMV启动子。所以表达水平较高，效果亦较好。

2、pCMV-EIA载体的鉴定：

由于再克隆步骤较多，为了确保在整个过程中DNA不发生重排及其他可能的变化，本发明对所构建的质粒进行了内切酶图谱的鉴定和序列分析。

(1)内切酶图谱鉴定：用AvaI酶切，获得5kb，1.35kb，0.75kb 3个片段。用XbaI酶切，获得6.6kb，0.5kb2个片段。用SacI酶切，获得5.2kb，1.9kb 2个片段。用HindIII和BamHI酶切，获得5.4kb，1.7kb 2个片段。均与预计相符。

(2)用ABI Prism 377测序仪测定EIA DNA序列，结果表明核苷酸序列与文献报道一致。二、细胞培养，基因转染及表达鉴定：

1、细胞株为来源于人头颈鳞癌颈部淋巴结转移灶的癌细胞株LN686，用含10％新生牛血清的DMEM/F-12培养基，于5％CO2，37℃孵箱培养。取生长至70％融合态的细胞，换为无血清培养基。将pCMV-EIA重组质粒或相应的空载体DNA与脂质体(LipofectAMINE^Tm，Gibco-BRL)按1∶3(w/w)比例混合后，室温静置20分钟，均匀加入到无血清培养的上述细胞中，无血清条件下培养10小时后，加入含20％血清的培养基继续培养48小时，加G418(800ug/ml)筛选抗性克隆，挑选单克隆化的细胞继续在含有400ug/mlG418的培养基中培养扩增。

2、转染后阳性克隆的鉴定：

(1)转染后阳性克隆中基因的整合

由于所用载体含neo基因，首先用细胞基因组DNA为模板，检查了neo基因在细胞基因组DNA中整合的情况。所用引物为1：5′-CAAGATGGATTGCACGCAGG-3′；引物2：5′-CCGCTGAGAAGAACTCGTC-3′，产物为790bp。反应条件为：95℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，32个循环后72℃延伸10分钟。然后用1.0％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。结果证明所转染DNA质粒已整合到受体细胞(六个克隆化细胞)的基因组中。

(2)RT-PCR分析EIA基因的表达：