[发明专利]一种新的多肽——锌指蛋白12.76和编码这种多肽的多核苷酸

说明书

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明描述了一种新的多肽——锌指蛋白12.76，以及编码此多肽的多核苷酸序列。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的制备方法和应用。

有一类调控蛋白质的DNA结合结构花式叫锌指结构。该调控蛋白质的活性需要Zn离子。在蛋白DNA结合结构域中，存在着一些有规律的正向重复单位。每个单位大约30个氨基酸，其中部10个氨基酸都是碱性或极性氨基酸。每个重复单位构成了结合DNA的“手指”。(孙乃恩等分子遗传学1990)锌指蛋白在生物活细胞中起着重要的作用，其中最重要的是作为转录调节因子发挥作用[Berg J.M.，Shi Y.etal.，Science，1996，271：1081-1085]。真核基因的转录调控对于基因的正常表达是十分重要的，通常由转录调控因子来完成这一调控过程。转录调控因子在生物体内参与决定基因在何种组织及何种发育阶段开始转录。编码这类蛋白的基因如发生突变，不但该基因自身不能正常表达，而且受其调节的许多基因也不能正常的进行转录与表达。锌指蛋白对基因表达的调控主要通过与特定的DNA序列结合来完成，现在发现也有一些锌指蛋白可与RNA结合以调节RNA的代谢。

典型的锌指蛋白为C₂H₂型，即Zn离子与两个半胱氨酸残基和两个组氨酸残基形成配位键。除了这四个氨基酸残基外，还有两个芳香族氨基酸残基和一个亮氨酸残基也高度保守。配位结构加上苯丙氨酸和亮氨酸所形成的疏水核心，确定了锌指结构的基本结构和形状。锌指结构的重复单位是：(苯丙氨酸，酪氨酸)-X氨基酸-半胱氨酸-(X氨基酸)-半胱氨酸-(X氨基酸)-苯丙氨酸-(X氨基酸)-亮氨酸-(X氨基酸)-组氨酸-(X氨基酸)-组氨酸-X氨基酸。(Miller，J.，McLachlan，A.D.&Klug，A.1985EMBOJ.4，1609-1914)在该重复单位中，那些与金属结合并同时形成“指”结构的氨基酸残基之间有间隔，而且，这些氨基酸是非常保守的。这些结构就构成了锌指蛋白的功能域。这些连续的氨基酸序列可以分为四部分。(Jeremy M.Berg 1988Proc.Natl.Acad.Sci USA.85，99-102)1.(苯丙氨酸，酪氨酸)-X氨基酸-半胱氨酸-(X氨基酸)-半胱氨酸-(X氨基酸)-苯丙氨酸构成半胱氨酸-半胱氨酸袢。每一个半胱氨酸-(X氨基酸)-半胱氨酸-(X氨基酸)结构都位于此袢的反向平行的β片层底部，该结构以氢键的形式分别与半胱氨酸残基的胺基基团和X氨基酸残基的羧基基团结合。2.紧接在1结构后的4个X氨基酸构成了顶端。3.(X氨基酸)-亮氨酸-(X氨基酸)-(X氨基酸)-组氨酸-(X氨基酸)-(X氨基酸)-(X氨基酸)-组氨酸构成组氨酸-组氨酸袢。该结构采取α-螺旋的形式，每一个组氨酸都以ε-N与金属离子配价。半胱氨酸-半胱氨酸袢和组氨酸-组氨酸袢结构可能以两种方式与锌离子形成配位键。一种方式：半胱氨酸-半胱氨酸袢的羧基端和组氨酸-组氨酸袢氨基端之间的距离大于15埃，该距离使得顶端的4个X氨基酸难以跨越。另一种方式：半胱氨酸-半胱氨酸袢的羧基端和组氨酸-组氨酸袢氨基端之间的距离压缩在8埃内，并且将两种芳香族氨基酸紧密地压缩在亮氨酸和组氨酸的两旁。这种方式将大部分芳香族氨基酸的疏水表面隐藏于半胱氨酸-半胱氨酸袢和组氨酸-组氨酸袢结构之内。两种方式的半胱氨酸-半胱氨酸袢和组氨酸-组氨酸袢结构在顶端以β-折叠1的方式连接。整个结构被组氨酸残基的支链扭转角和顶端区域的主链扭转角所调节。4.5个X氨基酸构成与临近功能域相连的接头。该结构部分的氨基酸序列非常保守，可以用(丝氨酸，苏氨酸)-(甘氨酸，脯氨酸)-谷氨酸-(赖氨酸，精氨酸)-(甘氨酸，脯氨酸)-(苯丙氨酸，酪氨酸)表示，其中最后一个氨基酸残基代表了半胱氨酸-半胱氨酸袢的第一个氨基酸。

通过基因芯片的分析发现，在膀胱粘膜、PMA+的Ecv304细胞株、LPS+的Ecv304细胞株胸腺、正常成纤维细胞1024NC、Fibroblast，生长因子刺激，1024NT、疤痕成fc生长因子刺激，1013HT、疤痕成fc未用生长因子刺激，1013HC、膀胱癌建株细胞EJ、膀胱癌旁、膀胱癌、肝癌、肝癌细胞株、胎皮、脾脏、前列腺癌、空肠腺癌、贲门癌中，本发明的多肽的表达谱与锌指蛋白的表达谱非常近似，因此二者功能也可能类似。本发明被命名为锌指蛋白12.76。