[发明专利]重建人t－PA分子及表达重建人t－PA蛋白的工程菌株

说明书

本发明涉及一种重建的新型t-PA分子及其重建方法，以及用于高效表达这种重建人t-PA蛋白的工程菌株。

血栓类疾病是常见病、多发病，随着我国人民生活水平的不断提高，人们营养摄入的不平衡，高脂化、血栓类疾病已成为危害人类健康的最危险的杀手，其中冠心病、心肌梗塞、脑血栓病已成为我国及全世界死亡多的流行病，并且有年青化的趋势，这些疾病的发生和发展均与不溶性纤维蛋白在血管壁沉积或血栓的形成有密切的关系。

血栓形成是指在机体心脏或血管内由血液的组成成份所形成的一种半固体凝块。血栓可在血循环的任何部分形成。在血管内处于流动状态的血液，会不断有不溶性的纤维蛋白的析出，贴附在血管壁内，形成薄层。同时血液循环中的溶纤系统的各种因子则不断将已析出的纤维蛋白溶解以排除其在血管中的沉积，使血凝与纤溶处于一种动态平衡，避免血管堵塞。在血液中的纤维蛋白酶原，可受各种激活因子作用而活化为纤溶酶。

纤溶酶原激活剂有链激酶(SK)、尿激酶(UK)和人组织型纤溶酶激活因子(t-PA)，由于SK和UK副作用大，缺乏溶纤特异性，造成溶纤酶原系统性激活，因此，在临床应用于心肌梗塞、脑血栓等疾病急救时用量大，且在溶血栓的同时极易引起内出血和脑出血，这同样是致命的。而t-PA来源于人组织，它能特异性地与血栓处的纤维蛋白结合，优先激活该处的纤溶酶原，因此使用起来效率高，专一性强，副作用小，安全性高，临床上应用能在短时间内使通血率达75％以上，这是所有的其它溶栓剂所不能比拟的。尽管如此，由于全长天然t-PA具有与纤溶酶激活物抑制物(PAⅠ)相互作用的结构，其活性很容易被PAⅠ所抑制。鉴此，研究开发一种增加和保留优点，克服缺点的新的t-PA的变异分子或重建分子是非常必要的。

本发明的目的在于提供一种重建的人t-PA分子及其重建方法，以及用于表达这种重建的人t-PA蛋白的工程菌株。这种重建的人t-PA分子应具有较高的溶纤活性和较强的特异性，并能在工程菌株中高效表达。

基于上述目的，本发明采用基因工程、分子生物学等先进技术，重建了一种人t-PA分子，并在工程菌中高效表达，纯化的这种重建t-PA蛋白分子，具有激活溶纤活性高、特异性强和稳定性高等特点。

为实现上述目的，本发明的所采用的具体技术方案如下：

一．t-PA基因重建过程：

根据对原型t-PA蛋白分子的结构与功能域分析估计，保留与特异性和激活有关的功能区域，去除无关的及与PA1抑制物结合的区域，设计了4条核苷酸引物，用RT-PCR法分别从脐带血管内皮细胞总RNA模板中扩增获得t-PA N端包括F-G区编码和C端P区编码的二个DNA片段(约0．3Kb和0．8Kb)分别克隆到puc-T载体中，转化DH5α菌株，鉴定后扩增质粒，用内切酶切割、低熔点琼脂糖电脉回收0．3和0．8Kbr DNA带，把编码N端氨基酸的0．3KbDNA定向克隆到原核表达载体pQE30的BamHⅠ-KpnⅠ位点，建成pQEtPAⅠ，把0．8Kb片段插入pQE30的KpnⅠ和HindⅢ之间，建成pQEtPA2，扩增pQEtPA1质粒DNA，用KpnⅠ和HindⅠ切割，定向插入0．8Kb的C端P编码区，建成pQEtPAr，pQEtPAr即本发明的tPA重建分子。经内切酶分析鉴定后，作全序列分析证实，重建的tPA分子与设计完全相符，pQEtPAr转化的JM109和M15产生的工程菌株均能表达出有激活溶纤酶原活性的tPA蛋白，分子量约41～42Kda，有良好的激活溶纤活性。

1． RT-PCR引物：(1)  5’ -GAG  CTC  ATG  AGA  TCT  TAC  CAA  GTG  ATC  TGC  AGA-3’                       BglⅡ(2)  5’ -GTC GAC GGT ACC CGTGGC CCT GGT ATC TAT-3’                  KpnⅠ(3)  5’ -GTC GAC GGT ACC TGC GGC CTG AGA CAG GAC-3’                  KpnⅠ(4)  5’ -AGA TCT AGA AGC TTC TCG AG TCA CGG TCG CAT GTT GTC-3’                      HindⅢ

2．RT-PCR法获得tPA基因DNA片段

引物(1)和(2)扩增0．3KbDNA，引物(3)和(4)为一对扩增0．8KbDNA。

RT-PCR反应混合物组成和条件为：