[发明专利]蛋白质二硫键色谱在线对接技术

说明书

本发明涉及生物工程。

目前，人们利用基因重组技术表达的蛋白质已达4000种以上，但真正用于临床的蛋白质却只有1％左右，其主要的原因是目前表达的蛋白质大部分是利用原核尤其是大肠杆菌(E.coli)作为表达系统，表达的蛋白质极易形成二硫键错接和形成没有生物学活性的包涵体而沉淀于细胞内。为了获得有生物学活性的蛋白质，必须对其进行正确地折叠复性。因此，折叠复性是绝大多数原核表达蛋白质必须的步骤。折叠的通常办法是先使用变性剂将包涵体溶解，再使用二硫键还原剂将二硫键还原。因此，进行折叠时最关键的一步也是最重要的第一步，就是将二硫键进行正确的对接，使之形成具有生物学活性的蛋白质。否则，蛋白质活性难以恢复。然而，在目前表达的4000多种蛋白质中能够自发地形成二硫键正确对接的蛋白质加上不含二硫键的蛋白质合计不足5％，其余95％的蛋白质在折叠过程中二硫键极易形成错接。由于目前还没有一个很好的技术能够解决二硫键正确对接的技术难题，直接制约了基因重组蛋白质利用率的进一步提高，造成了上游工程的巨大浪费。

目前，研究蛋白质二硫键对接的方法有以下两类：①在溶液中加入一定比例的氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽或通空气以及加入一些可以促进氧化和还原反应的试剂如Cu²⁺等，它存在三个最大的缺点：一是蛋白质二硫键在分子内以及分子间都容易错接，实验随意性较大，条件不易控制；二是在对接过程中，大部分蛋白质产生沉淀，只有一小部分进行对接；三是为了避免沉淀产生，需要100倍左右的稀释，造成体积大，后处理困难。②二硫键异构酶法，在蛋白质的复性溶液中加入二硫键异构酶，帮助错误对接的蛋白质改正，但该方法在溶液中重新引入了杂蛋白，而且二硫键异构酶的价格昂贵，只能作为理论研究，不能在实际生产中使用。本发明建立的二硫键色谱在线对接新技术则可以克服上述的缺陷。

本发明的目的是利用色谱在线对接技术解决多年来基因重组蛋白质表达后二硫键无法进行对接的技术难题，使基因工程表达的蛋白质在折叠时二硫键能够进行正确的对接。提高基因重组表达蛋白质的临床使用率，降低整个生物技术上游产业的成本，产生巨大的经济效益。为基因重组蛋白质尽快地从实验室走向临床提供技术上的支撑。

本发明的优点为：1．有高的正确对接效率和质量回收率；2．二硫键在色谱上进行二硫键对接的浓度高，体积比较小，后处理比较方便；3．色谱法将二硫键对接、蛋白质复性和纯化三者集为一身，使原来需要几步操作才能完成的工作，在色谱上一步就可以完成，大大简化了生产工艺。4．色谱方法很容易实现自动化，二硫键的对接程度可以实现人为的控制，容易进行工业化生产；5．成本低，色谱填料可循环使用100-1000次左右，大大将低了生产的成本。从以上可以看出，色谱法作为蛋白质二硫键对接的方法具有高效、快速、成本低、易控制、可实现自动化的优点。

本发明的技术方案：

所谓的“二硫键色谱在线对接技术”就是利用蛋白质在色谱填料上进行吸附-解析的过程(即分离纯化)的同时实现二硫键正确对接的技术。蛋白质二硫键在色谱上可以实现在线对接的理论依据是：①蛋白质分子在色谱柱上进行吸附时是以单分子层分布在填料表面上，避免了蛋白质分子之间的相互作用，表现出两个最大的优点：一是当加入的二硫键对接试剂时，由于分子之间的相互作用被避免，避免了分子之间二硫键错接，二硫键就只能在蛋白质分子内部进行对接，大大提高了二硫键正确对接的效率；二是由于分子间的相互作用被避免，蛋白质与蛋白质间就不会相互聚集产生沉淀，从根本上避免了传统折叠复性方法的大部分蛋白质产生沉淀的副反应，确保了表达的蛋白质都可以进行分子内的二硫键的对接，提高了二硫键对接蛋白质的数目。由于对接数目和正确对接比例的提高，使得色谱在线对接技术可以有一个高的对接效率。②从我们以前研究色谱热力学的结果提示，蛋白质在进行分子内二硫键对接时，色谱填料本身具有迫使蛋白质二硫键进行正确对接的趋势，蛋白质的复性就是利用该规律。③即使部分蛋白质二硫键不能形成分子内的正确对接，由于正确对接和不正确对接的蛋白质性质上的差异，利用色谱本身是用于分离蛋白质的特点，可在色谱上使两者得到完全的分离。不正确对接的蛋白质可通过设计一个自动回收装置使其在色谱上进行重新的对接，经过2-3次循环，不正确对接的蛋白质就可完全正确对接。另外，由于色谱是一个自动化程度很高的仪器，因此二硫键在色谱上实现对接时的对接效果可以通过改变色谱条件进行人为地控制。该技术是一个通用性的技术，适合于所有的蛋白质，能够使用该技术的色谱方法包括离子交换色谱、疏水作用色谱和亲和色谱。

1)填料的选择