[发明专利]双特异性单克隆抗体、其制备方法和用其制成的溶血栓剂

说明书

本发明属于生物制药领域，具体涉及用单克隆抗体工程方法生产抗血栓药物。

心血管类疾病，是危害人类健康的第一大类疾病。而心肌梗塞，是心血管疾病的一个重要方面。一旦发生心肌梗塞，患者必须立即用溶栓药物治疗，血栓溶解所需的时间对患者的康复是至关重要的。

大多数的心肌梗塞，是由于冠状动脉血栓形成引起的，可以用溶解血栓剂治疗。溶栓剂一般是纤维蛋白溶酶原激活剂，可以激活纤维蛋白溶酶原转化成纤维蛋白溶酶，后者使血栓中的纤维蛋白溶解，从而使血栓溶解。

链激酶、尿激酶和组织型纤溶酶原激酶(tPA)是三种广泛用于治疗血栓症的溶栓剂，已用于治疗急性心血管疾病如：心肌梗塞，脑卒中，肺栓塞，深度静脉血栓症，外周动脉阻塞等。链激酶、尿激酶和tPA等，由于对纤维蛋白专一性不高，因此对纤维蛋白溶酶原的激活无选择性，将使几种凝血因子包括纤维蛋白原、因子Ⅴ和因子Ⅷ等不同程度地降解，从而造成出血等副作用，严重危害患者的康复。

为了增加溶栓剂对血栓的专一性，减少溶栓剂的副作用，有人将尿激酶通过化学反应连接到抗纤维蛋白特异性抗体上，结果可明显地增强尿激酶对血栓的溶解能力达100倍以上。因此，可利用单克隆抗体的高度专一性，制备一个双特异性单克隆抗体，其一端专一性结合纤维蛋白，而另一端抗尿激酶等溶栓剂，从而开发一个具有较强溶栓能力及较小副作用的导向性新型溶栓物质。

应用化学连接技术以及杂交瘤技术等均可制备双特异性单克隆抗体。

Runge MS等人，通过二硫键，将抗纤维蛋白单克隆抗体的Fab’与抗单链tPA的单克隆抗体连接，得到双特异性单克隆抗体，这种双特异性单克隆抗体可使tPA的溶栓能力提高8.6倍。

Kurokawa T等人，将分泌抗尿激酶的单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞，与分泌抗人纤维蛋白的小鼠杂交瘤细胞融合，得到了分泌双特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，将该杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔，从小鼠腹水中收获双特异性单克隆抗体，该双特异性单克隆抗体对人纤维蛋白的亲合常数为2×10^-7，对尿激酶亲合常数为2×10^-8，当与尿激酶原和尿激酶结合时，对人血栓的溶栓能力可以分别提高20倍和5倍。

Harber等人，用杂交瘤技术制备双特异性单克隆抗体，其一端抗血栓纤维蛋白，另一端是抗溶栓制剂tPA。该双特异性单克隆抗体与纤维蛋白原没有交叉反应。将其注入体内后，会迅速富集定位到体内的血栓部位，并捕获内源性tPA，从而可降低tPA的剂量，增强溶解纤维蛋白能力和减轻tPA引起出血的副作用。

以化学的方法双制备功能单克隆抗体，反应难于控制，收率较低，实际意义不大。双特异性单克隆抗体的制备方法主要是在富含血清培养基中培养杂交瘤细胞而得到双特异性单克隆抗体。但是，由于高浓度血清的存在，细胞密度难于提高，因而抗体的表达量不高；此外，培养基中大量血清的存在，势必影响后续的抗体分离纯化，从而提高单克隆抗体的制造成本。

降低培养基中的血清浓度，是获得双特异性单克隆抗体的一个理想方法。但是，分泌双特异性单克隆抗体的杂交瘤必须同时保留四条表达四种抗体链的染色体，因此在降低血清的培养过程中有两个严重问题，一个是容易死亡，另一个是丢失产抗体链的染色体。所以，目前双特异性抗体的获得主要是以小鼠腹水方式，但这种方式由于存在人鼠共患疾病传播的可能性，根本上制约了双特异性单克隆抗体的实际应用。

各种杂交瘤细胞培养基都有一些基本一致的营养成分，如氨基酸、无机盐、维生素、葡萄糖及一些蛋白质添加物，包括生长因子、贴壁因子、激素、结合蛋白等。一些常规的培养基如MEM,DMEM,RPMI等基本上都含有这些成分。目前，细胞培养基主要还是以新生牛或胎牛血清作为主要成分。

血清培养存在许多缺点，首先各种血清必须广泛筛选，费时，代价高，而且无法保证一致，且潜在的血清细胞毒作用经常被忽视；另外，血清成分复杂，易给细胞培养带来污染，导致产物后处理困难。因此，无血清培养基的研究是细胞培养技术领域的一项重大课题。目前，已有用于杂交瘤细胞培养的商品化的无血清培养基。无血清培养基减少了操作费用和过程不稳定性，并去除了污染的可能性，但无血清培养基中添加的蛋白成分价格昂贵，而有的成分如BSZ等一般浓度较高，且杂质较多，致使表达产物分离纯化仍较困难。

杂交瘤细胞的培养，主要方式有批培养、补料培养和灌注培养等。