[发明专利]有效检测丙型肝炎病毒(HCV)的寡核苷酸引物及其应用方法

说明书

本发明涉及检测生物样品中核酸序列，特别是来源于传染性微生物的序列的改良的方法。

丙型肝炎病毒(HCV)是引起大多数输血后肝炎病例和全世界大部分偶发(或者群体获得性)肝炎病例的一种不经过肠胃传染的病毒。据估计世界人口的1％以上感染了HCV。急性肝炎、慢性肝炎、肝硬变和肝细胞癌都与HCV感染相关。

当前HCV分类为一个单独的属，即黄病毒科中的Hepacivirus。其基因组由大约9,500个核苷酸的一个正链RNA分子构成，其中含有一个编码大约3,000个氨基酸聚多蛋白前体的大的单一开放式阅读框架(ORF)。在该大的开放式阅读框架之前加上一个大约340核苷酸的5’-非编码区(NCR)，这是基因组中最保守的区域。ORF的5’区域编码(5’→3’方向)一个衣壳蛋白，二种包膜糖蛋白(E1和E2)以及一种未知功能的小蛋白(P7)。ORF的3’部分编码非结构蛋白，包括一种蛋白酶，蛋白酶/解旋酶双功能蛋白，RNA聚合酶和调节肽。在3’端亦包含一个NCR。

分析取自世界各地的HCV编码序列揭示不同的病毒分离株间具有显著的序列差异。进一步分析不同病人的HCV序列显示病毒以所谓的含有相关但不相同序列的“准种(quasi-species)”而传播。据认为在分离株间和不同病人间存在的差异是病毒编码的依赖RNA的RNA聚合酶低保真度的结果。HCV的遗传变异性程度对预防、诊断和控制感染具有重要影响。

HCV感染典型的血清学诊断是通过可商业化购得的检测结合重组HCV蛋白或肽的酶免疫分析法(EIA)而进行测定。阳性EIA结果可由一种重组免疫印迹分析法(RIBA)证实，但EIA和RIBA分析法都不能辨别过去的和现在的感染。由于传染病毒的典型低滴度，还没有成功地开发出一种直接分析病毒蛋白的方法。此外，基于抗体的分析法没有检测出一般暴露2-3个月后的HCV感染。

因此，该领域需要改进的灵敏分析HCV方法，足以检测病人接触HCV最初几天内的HCV病毒血症。

首先，本发明涉及一种检测生物样品中HCV RNA存在的方法。该方法包括：

(A)用样品来源的模板RNA进行逆转录反应以产生HCV特异的逆转录产物。

(B)用HCV特异性的一对或多对寡核苷酸引物扩增逆转录产物而产生HCV特异性扩增产物。

其中每对包括：

(a)选自以下序列的正向引物：

(i)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>，

(ii)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>，

(iii)5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID NO.3>；

(b)选自以下序列的反向引物：

(i)5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>，

(ii)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCA-3’(C282R27)<SEQ ID No.5>，

(iii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ ID No.6>，

(iv)5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>；

(c)检测扩增产物

检测到扩增产物表明样品中存在HCV RNA。

另一方面，本发明涉及一种扩增HCV DNA的方法。该方法包括：

(A)用HCV特异的一对或多对寡核苷酸引物对含有HCV DNA的DNA样品进行PCR以产生HCV特异性扩增产物。

其中每对引物包括：

(a)选自以下序列的正向引物：

(i)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>，

(ii)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>，

(iii)5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>；

(b)选自以下序列的反向引物：