[发明专利]烟草发状根培养法生产烟碱

权利要求书

1.高含量烟碱的转基因烟草发状根的制备方法，其特征在于该方法包括：

A.获取烟草无菌实生苗：将烟草种子作消毒处理，点播于盛有固体MSO培养基的培养皿中，待发芽后转接于盛有固体MSO培养基的100ml三角瓶中，待苗长至3～5周即可作侵染用；

B.侵染：取下烟草无菌实生苗的叶柄，用移液器向叶柄切口处点上少量A₄农杆菌菌液，将侵染有菌液的烟草叶柄放在盛有MSO固体培养基的培养皿上培养，待其长出1cm左右长的发根；

C.除菌：待被侵染的叶柄长出1cm左右的根后，用头孢毒素或羧苄霉素除去农杆菌。继续培养，当根长至2～3cm时将其从叶柄上切离，转至固体MSO的培养基上，在40℃下培养2天，至完全除菌；

D.继代：将除菌的单根在固体MSO培养基中培养。2～3周继代一次，使其量不断扩增，得到一定量的系列根系；

E.鉴定：用Southern杂交的方法检测步骤D中得到的系列根系，确定出含有T-DNA的根系，此根系即为转基因的发状根。

2.烟草发状根培养法生产烟碱的方法，包括将权利要求1制备的发状根进行扩大培养，接种到液体培养基，从培养液和发状根中提取烟碱步骤，其特征在于：所述的液体培养在气升式反应器中进行，采用改良的液体MSO培养基，28℃，无光照，培养1个月；所述的改良的MSO培养基配方为(mg/L)：MgSO₄·7H₂O 370，CaCl₂·2H₂O 440，KNO₃ 3984，KH₂PO₄ 170，FeSO₄·7H₂O 27.8，MnSO₄·4H₂O 22.3，KI 0.83，CoCl₂·6H₂O  0.025，ZnSO₄·7H₂O 8.6，CuSO₄·5H₂O 0.025，H₃BO₃ 6.2，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25。

3.如权利要求2所述的生产烟碱的方法，其特征在于所述的扩大培养是将发状根在MSO培养基中继续培养、继代2-3次。