[发明专利]一种抗植物花叶病毒蛋白

说明书

本发明涉及一利蛋白质，特别是一种新的来源于有毒植物种籽的植物花叶病毒抑制蛋白及其制备和应用。

本发明所述的蛋白可被定义为具有抑制植物花叶病毒的活性一抑制烟草花叶病毒(TMV)的活性。

烟草花叶病毒(TMV)引起的烟草花叶病是全世界范围内的烟草主要病虫害，在我国以东北、山东、河南、四川、云南等地受害严重。云南的发病率达20％。烟叶受害后，植株矮小，对产量和品质都有很大的影响(黄遵锡等西南农业学报vol10 No2 94-99,1997)。此外，烟草花叶病毒尚能侵染十字花科蔬菜如黄瓜、大白菜、油菜、蕃茄等，引起退绿、斑驳、甚至心叶畸形等，造成严重危害(盛方镜，陆关成浙江农业大学学报9:39-46,1983)。

对寄主细胞代谢有高度依赖性，对病毒有抑制作用的药物通常也对寄主产生药害(田波等《植物病毒弱毒疫苗》湖北科学出版社P4,1965)，因此，防治植物病毒在药剂筛选方面有较大困难。现已发现蘑菇等担子菌子实体抽出液对烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的侵染有抑制作用(都丸敬一等植物防疫29(1):1,1975)。Norifumi(Norifumi KOBAYASHI et,Agric.Biol.chem.51(31),883-890,1987)在香菇抽提液中分离纯化出植物花叶病毒抑制蛋白；M.M.Smookler(M.M.Smookler,Ann.Appl.Biol.69.157,1971)、J.D.Irvin(J.D.Irvin.Arch.Biochem.Biophics.169,552,1975)、S.Kubo(S.Kubo et,JapanPatent.S60-243100.1985(C.A.105.37465p,1985))和F.Osawa(F.Osawa et,Abstracts of Papers.llth Annual Meeting of thepesticide science Society of Japan.Tsukuba.march.P39 1986)等人分别在藜、美州商陆、紫茉莉、丝兰等植物中也发现了植物病毒抑制蛋白。我们从有毒植物种籽中分离出一种植物花叶病毒抑制蛋白。

本发明目的在于从有毒植物种籽中分离纯化含有较强的抑制烟草花叶病毒的活性的蛋白。

本发明采用简化、温和的分离纯化方法，包括盐溶液粗提、硫酸铵沉淀、G-25凝胶过滤脱盐、CM-纤维素阳离子交换层析和S-200凝胶过滤层析，得到高纯度高活性的豆薯种籽的抗植物花叶病毒蛋白，暂命名为PE4.

PE4的分离纯化流程见附图3，具体操作如下：

[1]粗提：将豆薯种籽100克粉碎，匀浆，用含0.05～0.1M NaCl的PH5.5～6.0,5mM磷酸缓冲液浸泡，4℃过夜。

[2]预处理：粗提掖用双层滤布去掉粗渣，滤液加硫酸铵至30～80％，经高速离心后，沉淀用少量PH5.5～6.0 5mM磷酸缓冲液溶解后上G-25柱脱盐。

[3]上CM-52柱：由[2]所得粗提样品上CM-52阳离子交换柱(预先用5～10mM PH5.0～6.0PB平衡)。用平衡缓冲液洗去杂蛋白，用含0～0.3M NaCl的同样PB进行梯度洗脱，收集洗脱峰C1(见附图)。

[4]上S-200柱：将[3]所得C1峰收集液，经浓缩、透析后，上预先用平衡缓冲液平衡过的S-200柱，并用平衡缓冲液洗脱，收集洗脱峰C1S(见附图)。

[5]冻干：由[4]所得C1S峰收集液，经充分透析后，冷冻干燥得冻干粉即为豆薯蛋白PE4。

本发明从有毒植物种籽-豆薯种籽中分离纯化出一种植物花叶病毒抑制蛋白PE4，其分子量约为9KD(SDS-PAGE检测)，接种实验表明它具有明显的抑制烟草花叶病毒(TMV)的活性，其平均抑制效率达到49.9％。

本发明的植物花叶病毒抑制蛋白，将通过植物转基因工程，获得具有抵抗植物病毒侵害能力的新的植株，在防治植物病毒侵害方面有实用价值。

本发明的植物花叶病毒抑制蛋白，将可在防治十字花科植物(黄瓜、大白菜、蕃茄等)受烟草花叶病毒侵害方面有使用价值。

本发明与现有技术相比，有以下积极效果：

1、本发明从有毒植物种籽-豆薯种籽-提取植物花叶病毒抑制蛋白，是新发现，国内外尚未见报道。

2、采用温和的提纯方法，设备简化易操作。

3、豆薯种籽来源丰富，价格便宜。

现对附图作简要说明：

图1．豆薯种籽蛋白PE4的分离纯化流程图；