[发明专利]快速杂交装置及方法

说明书

本发明涉及一种分子生物科技中快速杂交反应技术，更具体言之，涉及加速核酸杂交反应的方法及装置。

杂交技术的运用之一，即是利用不同生物体之间组成基本物质-核酸序列不同的特性，用以鉴别物种。将待测的核酸固定在基质上(譬如固体基质或滤膜等)，欲鉴定物种的特定核酸序列先以放射性物质或其他化学呈色物质或萤光物质等标记后，溶于溶液中，利用扩散或震力等使该二种核酸互补键结，经由感光、化学成色或激光来判读结果。

核酸杂交技术目前已广泛地应用在核酸测序，基因突变分析，及细菌、病毒的临床检测等。此技术主要是将两群单股的核酸一起反应，在一定的环境下彼此互补而形成双股核酸。杂交可归类为两种形式：溶液或液相杂交，如P.Wattre,55 Ann.Biol.Clin.25-31,1997所揭示；及固相杂交，请参考E.M.Southern,98 J.Mol,Biol.503-517,1975,F.C.Kafatos et al,7 Nucleic Acids Res.1541-1552,1979,D.Nanibhushan和D.Rabin,EP0228075,1987年7月8日，M.Grunstein和D.S.Hogness.72 Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,3961-3965,1975,A.R.Dunn和J.A.Hassell,12 Cell 23-36,1977，及Ranki等人的美国专利第4,563,419号。溶液或液相杂交的最大的缺点是原为双股的两群单股核酸(即探针核酸及靶核酸)均在溶液中，杂交过程中会个别与同组互补的序列杂交，降低两组核酸的杂交效率。而固相杂交是将其中一组核酸固定，可以克服此缺点。

固相杂交有许多种形式，最早源自于“Southern印迹杂交程序”，为E.M.Southem于98 J.Mol.Biol.503.517,1975所揭示。简言之，是将DNA转印至硝基纤维膜，此膜之后可供互补的DNA序列杂交。斑点杂交为F.C.Kafatos等人于7Nucleic AcidsRes.1541-1552,1979所发表，是将靶核酸点在膜上，以标记有放射性或其他呈色物质之探针核酸与之杂交，此技术已广泛使用在基因突变的分析，如D.Nanibhushan和D.Rabin于欧洲专利EP0228075所述，及其他分子生物学相关研究。

菌落杂交是M.Grunstein和D.S.Hogness.于72 Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.3961-3965,1975所揭示，将微生物(譬如细菌、噬菌体或其他微生物)固定在薄膜上，原位将其破碎，释出其核酸并使之变性之后固定，同样以标记有放射性或其他呈色物质的探针核酸与之杂交。

另有一种夹心式杂交法是A.R.Dunn和J.A.Hassell于12 Cell 23-36,1977以及Ranki等人的美国专利第4,563,419号，此方法使用两组探针核酸，第一组探针核酸固定在薄膜上，与靶核酸杂交，之后与第二组探针核酸杂交，最后再与抗体反应并呈色。此方法可以克服斑点杂交技术中人为将靶核酸点在薄膜上难以定量的缺点，但上述三种常用的杂交系统则有以下几项共通的缺点：

杂交程序是在液体环境进行，溶液中的核酸分子以扩散(布朗运动)的方式接近转印在薄膜上的核酸来达成杂交，是一种被动杂交，由于扩散速度缓慢，一般需做隔夜杂交，即需要十数小时以达到最佳的杂交效果，相当耗时。杂交耗时，易导致溶液中的核酸由单股的状态，与原本互补股的核酸单股结合，复性成双股，此情形发生在双股的DNA，或形成二级结构，此情形发生在RNA，造成杂交效率变差。

大部份核酸分子具高度复杂性，因此易发生不完全杂交或少数几个碱基不配对的情形，因此专一性较差。另一方面，由于核酸分子分散在溶液中，所以敏感度较差，一般少于100,000个靶核酸分子就检测不到，欲达到一定的敏感度，则需高浓度的核酸才能达成。再者，核酸对大部份材质具有高亲和性，令核酸在溶液中自由运动，自由选择结合的物质，在非最佳杂交条件下，容易与基质结合，结果造成严重的背景值。

习知方法利用提高反应温度，调整反应溶液的盐离子浓度及杂交后冲洗的条件，添加帮助分离双股的物质(如尿素、甲酰胺)等方式，以提高杂交专一性。然而最佳的杂交条件并不容易调整，而且专一性提高后往往降低反应敏感度。