[发明专利]对人免疫细胞有特异免疫刺激活性的CpG寡核酸

说明书

早在八十年代日本科学家发现卡介苗的DNA组分在人和动物体内具有抗肿瘤活性^[1]，九十年代初研究反义核酸治疗的科学家又发现人工合成的硫代寡核苷酸存在非特异的免疫刺激活性^[2]。1995年Krieg等揭示了上述现象的本质，发现核酸中的免疫刺激活性成分是一些含有未甲基化5’-CG-3’二核苷酸的六碱基特征序列，如5’-GACGTT-3’，5’-GACGTC-3’和5’-GGCGTT-3’等，核心碱基C和G为活性所必需，两端碱基也与其活性紧密相关^[3]。1996年Sato等又发现质粒DNA上的5’-AACGTT-3’六碱基特征序列能够明显增强DNA疫苗在小鼠体内的免疫效果^[4]。由于这些寡核苷酸都含有5’-CG-3’二核苷酸，所以统称为CpG寡核苷酸(CpG-ODN)。

功能性研究表明在体外CpG-ODN对小鼠免疫细胞有以下活性：(1)活化单核、巨噬细胞和树突状细胞，诱生IFN-αβ，IL-12和IL-18等细   胞因子，促进B₇和MHC II类分子的表达；(2)协同IFN-αβ和IL-12等细胞因子活化NK细胞，增强其杀伤活性，诱生IFN-γ；(3)多克隆活化B细胞，促进B细胞的增殖和分化，促进免疫球蛋白的产生，   促进B₇和MHC II类分子的表达。

因此，CpG-ODN可以作为一种疫苗佐剂，增强抗原提呈细胞对抗原的加工提呈，增加特异性抗体的产量，能够在IL-12和IFN-γ作用下诱导Th1类免疫应答，产生较强的细胞免疫。在小鼠，CpG-ODN已经用于鸡蛋溶菌酶、卵白蛋白、破伤风类毒素、乙肝表面抗原、灭活流感病毒，蛋白结合多糖以及DNA疫苗等多种疫苗和模型抗原的研究，都能够明显增强体液免疫和细胞免疫，并使免疫应答偏向Th1方向。联合使用CpG-ODN和Al(OH)₃作为基因工程乙肝疫苗佐剂，不但使表面抗原抗体滴度增加了35倍，而且还解除了铝佐剂对细胞免疫的抑制作用，产生了针对表面抗原的细胞免疫^[5]。

由于CpG-ODN诱导Th1而抑制Th2类免疫应答，因此可以用来治疗Th2类免疫应答介导的过敏反应性疾病，如哮喘等。此外，由于CpG-ODN能够活化多种免疫细胞，诱生多种细胞因子，具有非特异的免疫增强功能，因此还可以用来治疗肿瘤、感染性疾病和免疫功能低下或缺陷。

DNA疫苗在小鼠中取得了很好的免疫效果，其机理之一是CpG-ODN在DNA免疫中发挥了重要佐剂作用，但同样的DNA疫苗在人体中普遍存在DNA用量大、免疫反应弱的问题，这是否与CpG-ODN的免疫刺激活性存在种属差异性有关呢？是否存在对人免疫细胞具有特异免疫刺激活性的CpG-ODN呢？国际上一直没有关于这方面的系统报道，但零星资料表明，一些寡核苷酸对人免疫细胞也有刺激活性，而且不同序列的活性有所差别，提示可能存在人特异性CpG-ODN序列。如果确实存在人特异性CpG-ODN，那么可能对人类感染性疾病、过敏反应、免疫缺陷和肿瘤等疾病的预防和治疗具有潜在应用前景。因此，探索是否存在人特异性CpG-ODN并找出其特征序列就成为本发明的主要目的。

我们首先设计合成了几十个含有5’-CG-3’二核苷酸、长度为12个碱基的硫代CpG-ODN，并利用体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC)建立了筛选系统，发现了多个能够活化人B细胞的六碱基特征序列：其中四个特征序列对人B细胞有中度的免疫刺激活性，序列为5’-GACGTT-3’、5’-GACGTC-3’、5’-GGCGTT-3’和5’-GGCGTC-3’，和已发表的小鼠特征序列完全一致；而另两个特征序列对人B细胞有高度的免疫刺激活性，序列为5’-GTCGTC-3’和5’-GTCGTT-3’，第二位碱基均为“T”，而在小鼠特征序列中该位碱基为“G”或“A”。根据后两个特征序列，我们设计合成了一组含有2～6拷贝特征序列、长度为15～30个碱基的CpG-ODN，经筛选获得了多个对人免疫细胞有强免疫刺激活性的CpG-ODN。在实验过程中我们还发现存在两类特性有所差别的人特异性CpG-ODN：一类含有5’-GTCGTC-3’特征序列，对人免疫细胞具有高度的免疫刺激活性，而对小鼠脾细胞无免疫刺激活性，具有高度的人特异性；另一类含有5’-GTCGTT-3’特征序列，对人免疫细胞有较好的免疫刺激活性，对小鼠脾细胞也有交叉免疫刺激活性。综上所述，我们发现了两个对人免疫细胞具有高度免疫刺激活性的CpG特征序列并获得了多个对人免疫细胞有强免疫刺激活性的CpG-ODN。