[发明专利]棒杆菌的氨甲酰磷酸合成酶基因和生产L－精氨酸的方法

说明书

本发明涉及棒杆菌的氨甲酰磷酸合成酶，和它的编码基因。该基因可以用于氨甲酰磷酸合成酶和其亚单位的生产，繁育生产L-精氨酸的细菌和生产核酸的细菌等等。

氨甲酰磷酸合成酶是催化从碳酸，ATP，和谷氨酰胺生产氨甲酰磷酸的反应的酶。这些反应生成的氨甲酰磷酸的作用是在L-精氨酸生物合成途径中从鸟氨酸生产瓜氨酸的反应需要的氨甲酰基团的来源。另外，从天冬氨酸和氨甲酰磷酸生产的氨甲酰天冬氨酸是包括尿苷5’单磷酸的吡啶生物合成系统的一个中间产物。

氨甲酰磷酸合成酶包括两个亚单位，并且对于大肠杆菌或芽孢杆菌属的细菌，已知这些亚单位是carA和carB基因编码的。

但是，对于棒杆菌，还没有发现氨甲酰磷酸合成酶活性和其酶和其任何编码基因的阐述。

偶尔，报道了当在加入是氨甲酰磷酸合成酶的底物的谷氨酰胺的培养基中培养导入了含有基因carA，carB，argI和arg盒的质粒的大肠杆菌的转化体时，细胞内L-精氨酸的浓度相同于仅仅导入载体的对照菌株。但是，当转化体培养在加入谷氨酰胺以及是ArgI和氨甲酰磷酸的底物鸟氨酸的培养基中时，细胞内的L-精氨酸的浓度高于对照菌株的(Malamy M.等人，应用环境微生物学，63(1)，33(1997))。从这些结果表明，L-精氨酸的合成中决定速度的步骤是鸟氨酸的供应。

认为，供应鸟氨酸的速度决定步骤是N-乙酰谷氨酰胺合成酶(ArgA)是可能的。ArgA在大肠杆菌的生物合成途径中受到最后产物L-精氨酸的反馈抑制。

对于质粒扩增了编码反馈抑制脱敏ArgA的argA基因的菌株，甚至在只加入谷氨酰胺的培养基以及加入谷氨酰胺和鸟氨酸的培养基中细胞内L-精氨酸的浓度增加了。但是，在菌株培养时加入谷氨酰胺，或谷氨酰胺和鸟氨酸的情况中，同时在菌株中进一步扩增carA和carB基因的情况中没有观察到细胞内L-精氨酸的浓度的进一步增加(Malamy M.等人，应用环境微生物学，64(5)，1805(1998))。

在另一方面，还没有关于利用编码起源于棒杆菌的氨甲酰合成酶的基因增强微生物的L-精氨酸的生产能力的尝试的报道。

本发明的一个目的是提供棒杆菌的氨甲酰磷酸合成酶，编码它的基因，和利用该基因的微生物生产L-精氨酸的方法。

本发明的发明人为了达到前面提到的目的进行了扎实的研究。结果，本发明人成功地通过利用大肠杆菌的carB缺陷菌株从谷氨酸棒杆菌的野生型菌株获得含有carA基因和carB基因的DNA片段，并且完成了本发明。

即，本发明提供了下面的物质。

(1)编码下面(A)或(B)定义的多肽的DNA片段：

(A)具有至少含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第50-393位的氨基酸的氨基酸序列的多肽，

(3)具有至少含有包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加或倒置的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第50-393位的氨基酸的氨基酸序列，和能够构成具有氨甲酰磷酸合成酶活性，其含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的氨甲酰磷酸合成酶的大亚单位的蛋白质的多肽。

(2)编码在下面(C)或(D)中编码多肽的DNA片段：

(C)含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，

(D)含有包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加，或倒置的SEQID NO：3的氨基酸序列，并且能够构成具有氨甲酰磷酸合成酶活性，其氨甲酰磷酸合成酶的小亚单位具有至少含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第50-393位氨基酸的氨基酸序列的多肽。

(3)编码含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中包括了一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加或倒置，并且能够构成具有氨甲酰磷酸合成酶活性的蛋白质的多肽的DNA片段。

(4)编码下面(a)或(b)中定义的多肽，和下面(c)或(d)中定义的多肽的DNA片段：

(a)具有至少含有SEQ ID NO：2中氨基酸第50-393位的氨基酸序列的多肽，

(b)具有至少含有在SEQ ID NO：2中包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加或倒置的氨基酸第50-393位的氨基酸序列，并且构成具有氨甲酰磷酸合成酶，和含有SEQ ID NO：3的氨基酸磷酸合成酶的大亚单位的蛋白质的多肽，

(c)含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，