[发明专利]鼠神经生长因子的制备方法

摘要

本发明公开了一种鼠神经生长因子(NGF)的制备方法,它将传统工艺中的层析介质CM－52改为CM－FF。线性流速可提高到200cm/h,流速快,大大缩短了生产周期,适用于规模化生产。在颌下腺匀浆液离心后,使用CDR去脂,既提高了层析介质的使用效率,又增加了蛋白收量,此工艺的改进较适用于规模化生产。

主权项

1.一种神经生长因子(NGF)的制备方法，具体步骤为：鼠颌下腺经匀浆后，匀浆液反复冻融，冻融液8000rpm离心1小时，收集上清对0.02mol/LPB透析24小时，透析液上CM-52(I)柱，收集流穿液透析，酸解液上CM-52(II)柱，解离收NGF样。其特征在于，具体步骤改为：鼠颌下腺经匀浆后，匀浆液反复冻融，冻融液8000rpm离心1小时，取上清用CDR去脂过滤，收集滤液对0.02mol/LPB透析24小时，透析液上CM-FF(I)柱，收集流穿液透析，酸解液上CM-FF(II)柱，解离收NGF样。具体方法：a.采用细胞碎屑清除剂(CDR)介质去脂具体方法：取出经冻融的匀浆液，4℃8000rpm离心1小时，上清液用漏斗脱脂棉过滤，滤液加入CDR，100ml加入20gCDR，静置5分钟，步氏漏斗抽滤，收集去脂滤液包透析袋，4℃条件下对0.02mol/LpH＝6.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(PB)透析24小时。12小时换一次液，拆袋取透析内液置于烧杯内待用，透析液与滤液总量的比例为10∶1；b.采用高流速琼脂糖阳离子(CM-FF)进行两次柱层析I)高流速琼脂糖阳离子交换剂(CM-FF)(1)柱层析(1)装柱装柱前应检查垫圈密封性，上下连接管完好，并用无热原水试柱；密封时上下流速应一致；将检查完好的柱子垂直固定于支架上，打开上盖，夹紧下管，倒入无热原水约10～15cm柱高，打开下管排出气泡至余2cm柱高，用两倍于装柱介质的无热原水将介质稀释成糊状，沿壁缓慢加入柱中自然沉降至所需高度；装柱后，先以约两个柱床体积无热原水洗涤，线性流速100ml/h.cm2，然后用约4倍柱体积的pH6.8的0.02mol/LPB在100ml/h.cm2的速度平衡层析柱；(2)仪器调整与上样在层析柱用上样缓冲液平衡的条件下，打开紫外检测仪与记录仪，预热半小时；将层析柱出口管与紫外检测仪、记录仪相连，待检测仪基线走稳后调零点、量程、灵敏度、电压及走纸速度，调好后即可上样；以100ml/h.cm2的流速上样，待记录仪上有蛋白峰出现时，收集流出液；上样完毕，继用pH＝6.8的0.02mol/LPB流洗，直到流出液A280nm＜0.05为止(通常为下降至水平基线)；(3)酸化解离CM-FF(I)柱的流出液用透析袋包袋，每袋90～100ml，以pH6.8，0.25mmol/LPB透析24h；流出液与缓冲透析液比例为1∶10，其间换液1～2次；收集透析袋内液体，按总量的1/9加入pH4.0，0.5mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液(AB)，同时加入干烤的分析纯氯化钠(NaCl)至终浓度为0.4mol/L，4℃放置10分钟，8000rpm离心40分钟，取上层清液；(II)高流速琼脂糖阳离子交换剂(CM-FF)(II)柱层析装柱同CM-FF(I)柱，装柱量一般1000对鼠颌下腺装量100ml；水洗两个柱床体积后，以pH4.0，0.05mol/LAB加0.4mol/LNaCl(ABS)平衡后泵入酸解上清液，流速100ml/h.cm2，上样完毕，继用ABS洗柱至基线。再用两个以上柱床体积的pH4.0AB洗柱；用pH＝9.0的0.05mol/L三羧甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-Cl)洗脱杂蛋白，待杂蛋白洗脱至基线后，用pH＝9.0的0.05mol/LTris-Cl，并加入干烤NaCl至终浓度达0.4mol/L的缓冲溶液洗脱并收集目标蛋白峰即为NGF原液。