[发明专利]一种集成化纸基双模生物传感器检测miRNA-155的方法

摘要

本发明提供了一种集成化纸基双模生物传感器检测miRNA‑155的方法，属于miRNA的检测技术领域。在该发明过程中，构建了一种集成化纸基双模生物传感器，该设备以S1@CuCo‑CeO2纳米材料作为信号放大器，用于miRNA‑155的超灵敏传感。为了实现这一目标，首先合成了CuCo‑CeO2纳米球作为信号探针，然后将金纳米颗粒原位生长在纸基工作电极表面上，以提高电导率并促进修饰miRNA‑155修饰发夹探针；通过杂交链反应，CuCo‑CeO2可以成功地固定在纸基工作电极表面，用于定量检测miRNA‑155。最后，可以通过简单地转换纸基生物传感器的空间配置以实现双模式信号读取。

主权项

1.一种集成化纸基双模生物传感器检测miRNA-155的方法，其特征是包括以下步骤：/n（1） 利用水热法合成CuCo-CeO₂纳米材料，并将其与S1链连接，定义为链1，其碱基序列如核苷酸序列表所示，作为信号探针，用于H₂O₂的催化氧化；首先，将500 mg Ce（NO₃）₃·6H₂O和200 mg PVP溶解在14 mL乙二醇中，并在室温下搅拌30 min；然后，将0.5 mL的20 mg /mL的CuCl₂·2H₂O和0.5 mL的20 mg / mL的CoCl₂·6H₂O溶液添加至上述溶液；接下来，将混合溶液转移到容量为20 mL的聚四氟乙烯衬里的高压釜中，并在160 °C下加热8 h；反应完成后，将高压釜自然冷却至室温，收集产物并用双蒸水洗涤和无水酒精分别三次；最后，将产物在60 °C下干燥过夜，然后在300 °C下以1 °C / min的速度煅烧1 h，得到产物铜钴双掺杂二氧化铈纳米材料；然后将300 μL浓度为2μM的S1链滴加到CuCo-CeO₂的溶液中，并在4°C下搅拌12 h；然后，通过离心和洗涤除去未结合的S1链；最后，将获得的S1@CuCo-CeO₂分散在2 mL超纯水中，并在4 °C下保存；/n（2） 在计算机上利用Adobe Illustrator CS6软件设计一个疏水蜡打印图案并利用喷蜡打印机将其批量打印到裁剪的A4尺寸滤纸上，随后将其在加热板加热至蜡融化并渗透整个纸的厚度，形成疏水区域，该装置包括工作电极标签、中空区域、参比和对电极标签、显色区域、辅助标签和清洗标签；/n（3） 采用丝网印刷的方法，将碳工作电极印刷到Ⅰ区域，Ag/AgCl参比电极和碳对电极印刷到Ⅲ区域，碳电极印刷到反应区，将中空区域中疏水蜡包围的圆形亲水区域居中进行打孔；将显色区域的实线进行切割，然后将这些纸芯片进行折叠，形成一个立体结构；/n（4） 对检测区的圆形亲水工作区域进行功能化，首先通过种子溶液生长法生长金纳米粒子，具体生长步骤为：首先将80 mL二次水倒入三口烧瓶中加热至90 ℃，并加入800 μL质量分数为1%的氯金酸溶液，继续加热至96 ℃保持1 min，最后加入2.8 mL质量分数为1%的柠檬酸钠，继续加热15 min，自然冷却得到金种子溶液，取60 μL得到的金种子溶液滴加在工作区域，静置晾干，重复三次，用二次水冲洗3次，然后将将50 μL 浓度为2 μM 的H1链，定义为链2，其碱基序列如核苷酸序列表所示，滴加到金纳米粒子修饰的工作区域，并在室温下孵育18 h； 之后，将制备的电极用双蒸水洗涤，并用50 μL，浓度为1.0 mM的 6-巯基-1-己醇封闭1 h，以去除非特异性吸附；随后，将修饰好的工作区域与50 μL不同浓度的miRNA-155链，定义为链3，其碱基序列如核苷酸序列表所示，孵育；然后立即将50 μL浓度为2 μM的H2链，定义为链4，其碱基序列如核苷酸序列表所示，滴加到修饰的工作区域的表面，然后在37 °C下孵育2 h；随后，将50μL的 S1@ CuCo-CeO₂溶液引入改性的纸基工作电极中，用超纯水冲洗后，将修饰的电极在4 °C下孵育2 h；之后，将修饰过的电极用超纯水冲洗以除去未结合的链结构；/n（5） 在反应区圆形亲水区域进行修饰，具体步骤为：在圆形亲水区域中加入10 μL pH为7.0，浓度为0.1M的磷酸缓冲盐溶液； 然后将200 μL 浓度为5 mM 的H₂O₂溶液滴加到圆形亲水区域，然后在显色区域预埋20 μL浓度为20 mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液；/n（6） 对纸芯片进行简单折叠，完成对miRNA-155的检测，具体步骤如下：首先通过折叠将检测区域，参比电极和对电极区域，中空区域和显色区域重叠，辅助区域和清洗区域分别置于显色区域的上下两侧，完成电极的层层修饰后，对工作区域进行清洗，使检测区和电极标签重叠，用夹子固定，样式如附图2，与电化学工作站连接，将60 μL含有5.0 mM [Fe（CN）₆] ^{3-/4 -} pH为7.0，浓度为0.1M的磷酸缓冲盐溶液滴加到检测区域，进行测定并记录；/n（7）进行miRNA-155的显色检测，具体步骤如下：电信号测量过程完成后，将辅助标签和清洁标签抽掉，过氧化氢和信号探针流过中空区域并与预埋在显色区域的3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液反应，以实现可视化检测。/n