[发明专利]一种偶联抗EpCAM抗体的免疫磁珠富集检测CTCs的方法在审
| 申请号： | 201910863841.8 | 申请日： | 2019-09-12 |
| 公开（公告）号： | CN110456077A | 公开（公告）日： | 2019-11-15 |
| 发明（设计）人： | 卢英 | 申请（专利权）人： | 太仓极光克赛生物技术有限公司 |
| 主分类号： | G01N33/68 | 分类号： | G01N33/68;G01N33/577;G01N33/574 |
| 代理公司： | 11427 北京科家知识产权代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 陈娟<国际申请>=<国际公布>=<进入国 |
| 地址： | 215400江苏省苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明为一种偶联抗EpCAM抗体的免疫磁珠富集检测CTCs的方法：1、抗EpCAM单克隆抗体与磁珠偶联；2.制备循环肿瘤细胞样品：取免疫磁珠，加入生物肿瘤细胞样本中混匀，然后用磁力分离器分离，PBS清洗，将磁珠吸附细胞悬浮于PBS溶液中，进行细胞计数，使用细胞计数板检测富集到的细胞；将纳米免疫磁珠加入1ml人工肿瘤细胞血液样品中磁力分离，PBS清洗，然后将磁珠吸附细胞重新悬浮于PBS中；取5ul样品,滴加于载玻片上，使用抗EpCAM‑FICT,进行孵育，使用流式细胞仪对富集的细胞进行检测，肿瘤细胞‑荧光标记EpCAM鉴定有效性。在荧光倒置显微镜下进行计数，肿瘤细胞株细胞混入外周血后的富集、鉴定同上。极大地提高了循环肿瘤细胞检测的敏感性和特异性。 | ||
| 搜索关键词： | 细胞 肿瘤细胞 富集 循环肿瘤细胞 磁珠吸附 免疫磁珠 检测 荧光倒置显微镜 纳米免疫磁珠 抗EpCAM抗体 磁力分离器 单克隆抗体 流式细胞仪 细胞计数板 肿瘤细胞株 磁力分离 磁珠偶联 富集检测 细胞悬浮 血液样品 荧光标记 外周血 载玻片 滴加 孵育 混入 混匀 偶联 制备 样本 悬浮 | ||
【主权项】：
1.一种偶联抗EpCAM抗体的免疫磁珠富集检测CTCs的方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1.抗体与磁珠偶联：/n1)抗EpCAM单克隆抗体偶联前，在4℃下，经过三次透析，过夜，储存在PBS中，将浓度分别调整到5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L以及20μmol/L；/n2)纳米免疫磁珠的制备：/n取四份活化的羧基磁珠300μL，浓度2mg/mL，分别加入40μL浓度为5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L的抗EpCAM单克隆抗体，在1ml的离心管中，于室温下混合3h，用1ml的PBS清洗三次，加入300μL浓度为0.25mol/L甘氨酸混合25min，封闭剩余的醛基；再次用1ml的PBS清洗三次；加入含有质量百分比2.5％BSA的PBS溶液混合30min，封闭非特异性的吸附位点，之后用1ml的PBS清洗三次，加入300μL PBS缓冲液漩涡震荡，即得到浓度为2.0mg/ml的均匀的修饰有一抗的免疫磁珠；/nS2.制备循环肿瘤细胞样品：/n1)实验室培养各种肿瘤细胞样本，取各种肿瘤细胞，100μL，加入1.5mL离心管中，肿瘤细胞于外周血中制成人工样本，每种细胞为三管；/n2)取5μL上述制备好的各种肿瘤细胞与5mL健康人血液混合，每种细胞制备三管；/n3)取适量免疫磁珠，加入100ul生物肿瘤细胞样本中混匀，然后用磁力分离器分离，PBS清洗，将磁珠吸附细胞悬浮于PBS溶液中，进行细胞计数，使用细胞计数板检测富集到的细胞；/n4)将适量纳米免疫磁珠加入1ml人工肿瘤细胞血液样品中磁力分离，PBS清洗，然后将磁珠吸附细胞重新悬浮于PBS中；取5ul样品,滴加于载玻片上，使用抗EpCAM-FICT,进行孵育，使用流式细胞仪对富集的细胞进行检测，肿瘤细胞-荧光标记EpCAM鉴定有效性；在荧光倒置显微镜下进行计数，肿瘤细胞株细胞混入外周血后的富集、鉴定同上。/n
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