[发明专利]一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的制备及应用

摘要

本发明公开了一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的制备及应用，包括基因敲除质粒的构建、基因敲除质粒对宿主微生物的转化，腈水合酶基因的转化等步骤，可有效敲除或抑制多种微生物宿主的烟酸磷酸核糖转移酶、吡啶酰胺脱氨酶、异分支酸酶、半胱氨酸水解酶、嘌呤核酸磷酸酶，降低上述酶蛋白的活性或直接失活，减少生物催化过程中生成副产物羧基吡啶的生成，使得合成的产物中3‑吡啶甲酰胺、4‑吡啶甲酰胺的脱氨副产物3‑羧基吡啶、4‑羧基吡啶含量较低或不含有副产物，利用这些重组微生物可高得率催化制备副产物含量低的3‑吡啶甲酰胺、4‑吡啶甲酰胺产品。

主权项

1.一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的制备方法，其特征在于，通过如下具体步骤制备：(1)根据靶蛋白基因序列设计合成两对突变引物，以宿主微生物基因组为模板，利用突变引物PCR扩增靶蛋白突变体基因，再利用靶蛋白突变体基因重组构建基因敲除质粒；(2)将基因敲除质粒转化进入宿主微生物中，利用同源重组或基因编辑方法使靶蛋白基因中至少一个酶活性相关基因突变，进而敲除或失活靶基因或靶蛋白，最终使得靶蛋白的酶活性降低或完全丧失；所述靶基因或蛋白质包括但不限于烟酸磷酸核糖转移酶、吡啶酰胺脱氨酶、异分支酸酶、半胱氨酸水解酶、嘌呤核酸磷酸酶，所述靶蛋白的主要催化产物为3‑羧基吡啶、4‑羧基吡啶；(3)通过基因重组方法将腈水合酶基因以游离质粒或以基因敲入整合至基因组的方式，使微生物具有催化3‑氰基吡啶、4‑氰基吡啶等氰基吡啶化合物转化为3‑吡啶甲酰胺、4‑吡啶甲酰胺等甲酰胺吡啶化合物的能力即得低副产物吡啶甲酰胺转化微生物。