[发明专利]一种泡球蚴感染动物中肝细胞与肝星状细胞的分离方法

摘要

本发明为一种泡球蚴感染动物中肝细胞与肝星状细胞的分离方法。一种泡球蚴感染动物中肝细胞与肝星状细胞的分离方法，包括：(1)原位灌注：在泡球蚴感染动物肝脏中，经门静脉，依次用前灌注液、后灌注液1和后灌注液2原位灌注肝脏后，取下肝脏制成肝内细胞悬液；(2)梯度离心：将肝内细胞悬液离心后，得上清液1和下层的沉淀物1；用D‑Hanks液离心洗涤沉淀物1，得肝细胞；将上清液1离心后，收集下层的沉淀物2；向沉淀物2中依次加入GBSS‑B、Nycodenz分离液、GBSS‑B，离心，收集白色的环状层，用GBSS‑B离心洗涤，弃上清液，得肝星状细胞。本发明所述的一种泡球蚴感染动物中肝细胞与肝星状细胞的分离方法，可同时提取分离出泡球蚴感染动物中的肝细胞与肝星状细胞。

主权项

1.一种泡球蚴感染动物中肝细胞与肝星状细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)原位灌注：利用恒温加热套，恒流泵连接闭合的无菌管道系统，对泡球蚴感染动物门静脉原位灌注肝脏，先用前灌注液进行灌注，至肝脏变白后，再依次用后灌注液1和后灌注液2进行灌注；灌注结束后，取下肝脏置于无菌培养皿，加入高糖DMEM溶液1，撕开肝被膜，反复吹打，用37℃摇床干浴，弃去泡球蚴感染病灶，过滤，得到肝内细胞悬液；(2)梯度离心：将肝内细胞悬液离心2次后，得上清液1和下层的沉淀物1；用D‑Hanks液离心洗涤沉淀物1，得肝细胞；将上清液1离心后，分层，收集下层的沉淀物2；向沉淀物2中加入GBSS‑B重悬后，加入Nycodenz分离液并混匀，再加入GBSS‑B，离心，分成3层，收集在中间形成白色的环状层，用GBSS‑B离心洗涤，弃上清液，得肝星状细胞；其中，所述的前灌注液为含有0.5mmol/L EDTA的D‑Hanks液；所述的后灌注液1为含有0.5mg/mL蛋白酶E的D‑Hanks液；所述的后灌注液2为含有200U/mLⅠ型胶原酶的D‑Hanks液；所述的高糖DMEM溶液1中含有200u/mlⅠ型胶原酶和0.5mg/ml蛋白酶E；所述的Nycodenz分离液中Nycodenz与GBSS‑A的质量体积比为4.94g：17mL。