[发明专利]携带1型BVDV-Erns

摘要

本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种携带1型BVDV‑Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法。本发明利用分子克隆以及反向遗传方法，将CSFV‑C株基因组的Erns和E2基因的VR1区分别用BVDV1的Erns基因及CSFV流行株QZ14的VR1区进行置换，并向C株基因组7个特定位点引入突变，得到重组病毒rC‑Marker1。该重组病毒带有外源标记(BVDV Erns)、CSFV流行毒株E2基因的VR1区以及特定的突变位点，为开发适合体外细胞培养体系的猪瘟标记疫苗奠定基础。应用该技术构建的重组嵌合猪瘟病毒弱毒标记疫苗株，能够快速判断猪瘟病毒阳性血清是由于野毒感染还是接种疫苗引起，接种该弱毒标记疫苗株诱导的血清抗体对猪瘟病毒2型流行毒株有较好的中和能力，可以降低疫苗生产成本。

主权项

1.一种携带1型BVDV‑E^rns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将GenBank登录号为KC695814.1的人工合成的BVDV1型毒株VEDEVAC E^rns基因序列克隆于pUC57，得到重组质粒pUC57‑B1E^rns；以该重组质粒为模板，PCR扩增其E^rns基因片段；(2)通过一步定向克隆法，将步骤(1)获得的BVDV1 VEDEVAC株E^rns基因片段克隆至CSFV‑C株感染性克隆质粒pA‑FL22，置换CSFV的E^rns基因片段，得到携带BVDV1型E^rns基因的重组CSFV感染性克隆pCSFV‑C‑B1E^rns；(3)以CSFV基因2型流行毒株QZ14基因组cDNA为模板，PCR扩增其E2基因的VR1区7‑126nt片段；(4)通过一步定向克隆法，将步骤(3)所获QZ14株的VR1片段克隆至步骤(2)所获的pCSFV‑C‑B1E^rns中，以置换C株E2基因的VR1片段，得到携带BVDV1型E^rns基因和CSFV流行毒株VR1片段的重组CSFV感染性克隆pCSFV‑C‑B1E^rns‑VR1；(5)用带有突变位点的引物，结合一步定向克隆法，将C株基因组上特定的7个突变位点引入重组感染性克隆中，得到携带BVDV1型E^rns基因和CSFV流行毒株VR1片段以及7个特定突变位点的重组CSFV感染性克隆pCSFV‑Cm7‑B1E^rns‑VR1；所述7个突变位点为T3310G、C3433T、G3531T、A4085G、C8286A、A10332G和A11836C，对应的氨基酸变化为：M979R、A1020V、V1053L、I1237M、L2638I、S3320G和K3821T；(6)将步骤(5)得到的感染性克隆pCSFV‑Cm7‑B1E^rns‑VR1酶切线性化，体外转录得到重组嵌合CSFV病毒Cm7‑B1E^rns‑VR1的基因组RNA；(7)将步骤(6)得到的基因组RNA电转入猪肾细胞PK‑15中，通过连续传代的方式获得携带BVDV1型E^rns基因和CSFV流行毒株VR1片段以及7个特定突变位点的重组病毒Cm7‑B1E^rns‑VR1。