[发明专利]一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用

摘要

本发明涉及一种高产L‑半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备L‑半胱氨酸中的应用。本发明构建了高产L‑半胱氨酸的基因工程菌，经过改造后的大肠杆菌相比于野生型能够更好的利用葡萄糖等碳源物质进行L‑半胱氨酸生产，并且其产量从无提高到3.0±0.1g/L。本发明进一步改造的L‑半胱氨酸转运系统可以减轻产物L‑半胱氨酸对cysE的反馈抑制作用以及其毒害性，达到高产L‑半胱氨酸。

主权项

1.一种高产L‑半胱氨酸的基因工程菌，由如下方法构建而成：(1)将底盘菌E.coli W3110基因组中的serA基因、serB基因和serC基因的启动子更换为trc启动子，得到E.coli W3110 serA serB serC(trc)；(2)应用CRISPR‑Cas9基因编辑将E.coli W3110 serA serB serC(trc)中serA基因编码的氨基酸进行H344A/N346A/N364A点突变，得到对胞内丝氨酸浓度耐受性增强的E.coli W3110 serA^fbr serB serC；(3)将E.coli serA^fbrserB serC(trc)基因组中的sdaA基因、sdaB基因和tdcG基因敲除，得到E.coli W3110 serA^fbr serB serC(trc)ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG；(4)将E.coli W3110 serA^fbr serB serC(trc)ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG的cysE基因启动子替换为trc启动子，增强cysE基因表达，得到E.coli W3110 serA^fbr serB serC cysE(trc)ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG；(5)将E.coli W3110 serA^fbrserB serC cysE(trc)ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG中cysE基因编码的氨基酸进行T167A/G245S点突变，得到对胞内半胱氨酸浓度耐受性增强的E.coli W3110 serA^fbr serB serC cysE^fbr(trc)ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG；(6)将E.coli W3110 serA^fbrserA serB serC cysE^fbr(trc)ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG的cysB基因启动子替换为trc启动子，增强cysB基因表达，得到E.coli W3110 serA^fbr serB serC cysE^fbr cysB(trc)ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG；(7)将E.coli W3110 serA^fbr serB serC cysE^fbr cysB(trc)ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG基因组中的Tnaa基因和Yham基因敲除，得到E.coli W3110 serA^fbrserA serB serC cysE^fbrcysB(trc)ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG ΔTnaa ΔYham；(8)将来自Escherichia coli W3110的eama基因与利用XbaI和PstI限制性内切酶处理的pTrc99A进行连接，得到pTrc99A/eama，与来自E.coli W3110 serA^fbrserA serB serC cysE ^fbrcysB(trc)ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG ΔTnaa ΔYham的点突变后的cysE基因拼接，得到Ptrc99A/eama/cysE^fbr；(9)将质粒Ptrc99A/eama/cysE^fbr转入E.coli W3110 serA^fbr serB serC cysE ^fbrcysB(trc)ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG ΔTnaa ΔYham感受态细胞中，得到重组基因工程菌W3110 serA^fbrserA serB serC cysE ^fbrcysB(trc)ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG ΔTnaa ΔYham Ptrc99A/eama/cysE^fbr；(10)将重组基因工程菌W3110 serA^fbrserA serB serC cysE ^fbrcysB(trc)ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG ΔTnaa ΔYham Ptrc99A/eama/cysE^fbr基因组中的yciW基因敲除，得到E.coli W3110 serA^fbr serB serC cysE^fbr cysB(trc)ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG ΔTnaa ΔYham ΔyciW Ptrc99A/eama/cysE^fbr，即所述高产L‑半胱氨酸的基因工程菌。