[发明专利]热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法

摘要

本发明涉及一种热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法，属于生物安全与生物防治技术领域，具体包括首先调查了不同高温和时间条件下，莲草直胸跳甲不同发育阶段，如卵，1龄，2龄，3龄幼虫，蛹及成虫的存活率，通过其耐热性差异比较，选取耐热性最差的虫态进行了短时高温下整个种群在各发育阶段的存活、寿命、繁殖力等生命参数的观察；通过明确莲草直胸跳甲高温耐受性最差的虫态和影响的关键温度,然后系统鉴定莲草直胸跳甲所有热激蛋白家族基因。最后通过实时荧光定量PCR分析热激蛋白基因与温度适应性的关系，探讨热激蛋白基因诱导表达的最大值是否可以作为一种生物指示剂来指示物种对温度的耐受极限。本发明能够准确了解引进昆虫对温度的耐受性，大大缩短昆虫引进周期。

主权项

1.热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法，其特征在于：按照以下步骤进行，a、昆虫样品的高温处理收集莲草直胸跳甲12h内所产的卵，按照6个不同的发育阶段卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹、成虫，将卵分为6组，各组卵均置于25℃、相对湿度85±5％、光照周期14L:10D的养虫室中饲养，处理温度为32.5℃，35℃，37.5℃，40℃，42.5℃，45(±0.5℃)，处理时间为1h，3h，5h，每个处理为5个重复，每个重复供试虫量100～150头，热处理结束后，将热暴露后的莲草直胸跳甲转移至25℃养虫室继续饲养；b、短时高温对莲草直胸跳甲种群的影响对经过短时高温处理的各虫态的存活率数据进行分析，选取关键的热敏感虫态、温度及时间处理组合进行生命表观察和数据记录，然后对生命表数据分析，最终明确高温对莲草直胸跳甲种群的影响；在进行生命表数据分析时，根据年龄‑阶段两性生命表的理论和方法，利用http://140.120.197.173/Ecology/Download/TWOSEXMSChart.rar所提供的计算机程序TWOSEX‑MSChart，分析了莲草直胸跳甲不同发育阶段的存活率、寿命和繁殖力等所有原始数据；因为莲草直胸跳甲是群体饲养的，所以记录了在每个阶段，存活至年龄为x的个体的数量；其中涉及的生命参数包括特定年龄‑阶段特异性存活率，计算如下：其中n₀₁是在生命表试验开始时卵的数量，s_xj，表示新孵化个体存活至第x天和第j阶段的比率，n_xj是存活到第x天和第j阶段的跳甲数量；雌性年龄‑阶段特异性繁殖力f_x4计算公式如下：其中E_x表示所有雌性成虫(第4阶段)在x天时产卵的总数，n_x4是雌性成虫存活到第x天的数量；根据Chi和Liu(Bulletin of the Institute of Zoology Academia Sinica,24(2):225‑240)，净生殖率R₀表示一个体在其生命期内可以产生的后代的总数，计算公式为：其中m是生命阶段的数目,lx是年龄特异性存活率(新产的卵存活到第x天的概率)，mx是年龄特异性繁殖力(第x天个体的平均繁殖力)；l_x和m_x的计算如下：用迭代对分法和Euler‑Lotka方程，估算了年龄指数从0开始的内禀增长率r，公式如下：周限增长率λ，平均世代周期T等，计算如下：λ＝e^r，用Bootstrap法估计各处理种群参数的标准误，该方法需要每个个体的寿命和雌成虫的日繁殖力，每个个体的寿命和性别可以根据个体的存活状态来计算；雌虫的平均繁殖力可以根据每头雌虫每天产卵的数量来估算；根据Chi(Environmental Entomology,17(1):26‑34)证明的R₀和F之间的关系，该方法不会影响l_x或m_x，因此，也不会影响群体参数；由于雌性寿命不同，这种方法仍然可以揭示其对雌性繁殖力的影响，对于发育时间，寿命，繁殖力和种群参数的方差和标准差估算，均采用采用Bootstrap方法，进行100,000次抽样，处理间的差异用配对Paired Bootstrap方法进行检验(B＝100,000)，基于95％置信区间进行比较；c、实时荧光定量PCR分析热激蛋白基因与温度适应性的关系鉴定完莲草直胸跳甲所有热激蛋白家族基因后，提取热敏感虫态(卵)不同温度条件下的总RNA，提取完成后，利用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，核酸蛋白检测仪测定其浓度和纯度，然后‑80℃保存备用；然后再对RNA进行纯化处理，处理完成后，利用电泳检测基因组DNA是否去除干净，如没有完全去除，增加DNase I的量和反应的时间直至完全去除，然后‑80℃保存备用；最后在再对RNA进行反转录和实时荧光定量PCR；在进行实时荧光定量PCR时，取27个HSP基因和内参基因β‑actin的PCR引物，实时荧光定量PCR的反应总体系为20μL，其中包括10μL的 Select Master Mix(Applied Biosystems)，2μM的基因特异性引物和2μL的莲草直胸跳甲cDNA模板，整个反应在ABI 7500上进行，相对定量的数据使用ABI 7500 SDS v2.2.6软件生成，每个样品3次技术重复，β‑actin作为内参基因，热激蛋白基因mRNA的相对表达量数据采用2‑△△CT法处理计算；相关热循环参数设置如下：