[发明专利]促进牛体外胚胎培养卵母细胞体外成熟的方法

摘要

本发明涉及促进牛体外胚胎培养卵母细胞体外成熟的方法。其中牛体外受精胚胎培养的方法包括如下步骤：(1)卵母细胞的采集和体外成熟，在进行体外成熟操作时，将离体采集或者活体采集所得COCs在卵母细胞成熟培养液中洗涤1次，再转移到新的成熟培养液中培养22‑24h，培养条件为38.8℃、5.5‑6.5％CO2、饱和湿度；(2)体外受精；(3)胚胎体外培养及保存，保存时可以置入液氮中冷冻保存。特别地，采用本发明方法尤其是其中的成熟液可以有效提高卵母细胞体外成熟率。

主权项

1.牛体外受精胚胎培养的方法，其包括如下步骤：(1)卵母细胞的采集和体外成熟离体采集：取屠宰场卵巢盛放于加双抗生理盐水的保温桶中，30.5‑33℃条件下，4h内运回实验室；抽取表面2‑8mm的卵泡，收集沉淀，在体视显微镜下捡出至少含有3层卵丘细胞包裹的卵母细胞COCs即卵丘‑卵母细胞复合体，在洗卵液中洗涤2遍，去除多余杂质；活体采集：对牛进行活体采卵，将所得卵泡液在体视显微镜下捡出至少含3层卵丘细胞包裹的卵丘‑卵母细胞复合体，放入包含HEPES的成熟培养液中38.8℃、3h内运回实验室；将以上离体采集或者活体采集所得COCs在卵母细胞成熟培养液中洗涤1次，再转移到新的成熟培养液中培养22‑24h，培养条件为38.8℃、5.5‑6.5％CO2、饱和湿度；(2)体外受精将成熟的COCs在受精培养液中洗涤1次，再转移到受精培养液中，放入培养箱中，备用；从液氮中取一支冻精细管，37℃水浴解冻；无菌操作剪开细管两端，使精液注入盛有精液制备培养液的15mL离心管中，328×g离心2次，每次5min，离心后弃上清；将300μL精液制备培养液加入上述离心管，重悬精子沉淀，取适当的精子悬液进行精子计数；将计算好体积的精子悬液加入盛有卵母细胞的受精培养液滴中，并将培养盘放入培养箱，使精卵共孵育16‑20h，培养条件为38.8℃、5.5‑6.5％CO2、饱和湿度；(3)胚胎体外培养及保存体外受精操作完毕后，将胚胎周围的颗粒细胞用剥卵针去除干净，放入胚胎培养液中培养，此时记为胚胎培养的第1天，培养条件为38.8℃、6％O2、88％N2、饱和湿度，第3天记录卵裂率；第7天记录囊胚率，至第9天时统计囊胚孵化率，并进行质量鉴定；将可用胚胎在保存液中洗涤3次，在平衡液中平衡10min后转移入冷冻液，按5段装液法装入胚胎，做好标记，再放入程序降温仪中按照0.5℃/min的速度降至‑35℃后，将胚胎细管迅速取出，置入液氮中冷冻保存。