[发明专利]一种干细胞外泌体的制备方法及新应用

摘要

本发明涉及生物制剂领域，具体涉及一种干细胞外泌体的制备方法及新应用。该方法包括间充质干细胞外泌体的提取、经动脉血管腔内成形联合干细胞外泌体移植的方法治疗糖尿病足的新应用。该外泌体新应用能准确、有效的改善糖尿病足的微循环，促进血管生成，重建毛细血管网，减少闭塞血管再狭窄，降低截肢率及提供生存率。

主权项

1.一种干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：具体制备步骤为：步骤一：从低温容器中取出间充质干细胞(MSC)，迅速置于37℃水浴中连续晃动，1min内快速解冻；步骤二：在无菌条件下，将完全解冻的细胞悬液转移至含有10ml无血清细胞培养基的离心管中；1500rpm离心5min，吸弃离心后上清；步骤三：用培养基调整细胞接种密度为1.0×10⁴个活细胞/cm2，将细胞悬液加入培养器皿中，轻轻摇晃使细胞均匀分布；观察细胞状态，隔天换液；步骤四：在4℃下进行干细胞外泌体分离：2000g，10分钟，10,000g，20分钟；步骤五：通过Beckman Coulter超速离心机以100,000g超速离心120分钟来分离干细胞外泌体；步骤六：收集沉淀的干细胞外泌体，并重悬于无菌PBS中；步骤七：随后通过蔗糖梯度离心进一步纯化干细胞外泌体，将干细胞外泌体在800ul HEPES中稀释，并通过1:1稀释与80％蔗糖混合，得到最终浓度为40％的蔗糖，将混合物置于4ml超速离心管的底部，小心的将1.6ml的30％蔗糖在HEPES中分层，然后在顶部加入下一层5％的蔗糖；步骤八：将管移至SW60Ti转子并在100,000g下离心16小时；此后，收集12个等的级层，级层2至7含有纯化的外泌体；步骤九：通过离心90分钟，100,000g洗涤外来体；反复多次提取1mg外泌体与10ml生理盐水充分混合，制备干细胞外泌体注射液备用。