[发明专利]一种利用dUTP或dTTP检测核酸中腺嘌呤N6或N1位发生甲基化修饰的方法

摘要

本发明公开了一种利用dUTP或dTTP检测核酸中腺嘌呤N6或N1位发生甲基化修饰的方法。该检测方法主要由两部分组成：第一部分是通过延伸反应将三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸（dUTP）或三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）掺入DNA序列。第二部分是通过变性聚丙烯酰胺凝胶分析得到含有不同位点的链的延伸百分比，处理后可判断含有不同位点的链的延伸速率从而达到识别检测N6‑甲基腺嘌呤和N1‑甲基腺嘌呤的目的。该方法克服了现有检测方法设备需求高、原料昂贵、操作繁琐等不足，灵敏度高、适应范围广。

主权项

1.一种利用三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸或三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸识别带有N⁶‑甲基腺嘌呤或N¹‑甲基腺嘌呤的核酸的方法，其特征在于，具体包括：(1)以三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸或三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸作为DNA合成的原料，在紧邻疑为N⁶‑甲基腺嘌呤或N¹‑甲基腺嘌呤的位点上游根据模板链序列设计一条长度为17‑20bp的引物，在DNA聚合酶或逆转录酶作用下与核酸共孵育进行延伸反应，以将三磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸或三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸掺入序列，所述核酸为疑为含N⁶‑甲基腺嘌呤或N¹‑甲基腺嘌呤的位点的待测核酸或对照核酸，所述对照核酸为对应位点不含N⁶‑甲基腺嘌呤或N¹‑甲基腺嘌呤、序列与待测核酸相近且其他位点含N⁶‑甲基腺嘌呤或N¹‑甲基腺嘌呤水平与待测核酸相同的核酸；(2)步骤(1)延伸产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶分析，经凝胶成像仪测定被延伸的底物浓度和未被延伸的底物浓度，得到延伸百分比，所述延伸百分比为：延伸百分比＝被延伸的底物浓度/(被延伸的底物浓度+未被延伸的底物浓度)；(3)结果判定：如果待测核酸的延伸百分比小于对照核酸的延伸百分比，即可识别待测核酸为带有N⁶‑甲基腺嘌呤或N¹‑甲基腺嘌呤的核酸；同时通过进一步用含N⁶‑甲基腺嘌呤的核酸替代步骤(1)的对照核酸成为新的对照核酸进行实验，若二十分钟后待测核酸的延伸百分比远小于新的对照核酸的延伸百分比，即可识别待测核酸为带有N¹‑甲基腺嘌呤的核酸，若反应半分钟至两分钟内待测核酸的延伸百分比小于新的对照核酸的延伸百分比，两分钟后延伸百分比接近，即可识别待测核酸为带有N⁶‑甲基腺嘌呤的核酸。