[发明专利]一种加入LPS的新的NAFLD细胞模型的制备方法

摘要

本发明公开了一种加入LPS的新的NAFLD的细胞模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)细胞增殖与毒性实验：A.实验分组：分成实验组一和实验组二两个分组；实验组一：将浓度分别为200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、1600ng/mL的LPS加入L02细胞中，分别培养24h、48h和72h，筛选LPS的浓度；实验组二：将0.4mM的棕榈酸分别按照200ng/mL+PA、400ng/mL+PA、800ng/mL+PA、1600ng/mL+PA加入L02细胞中，分别培养24h、48h和72h。本发明具有如下优点：在传统NAFLD细胞模型基础之上，综合考虑消化道菌群代谢产物LPS的影响对NAFLD疾病发生发展的影响，为疾病的预防和临床治疗提供了更为可靠的依据，亦为相关疾病的体外机制研究提供了细胞模型和实验基础。

主权项

1.一种加入LPS的新的NAFLD的细胞模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)细胞增殖与毒性实验：A.实验分组：分成实验组一和实验组二两个分组；实验组一：将浓度分别为200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、1600ng/mL的LPS加入L02细胞中，分别培养24h、48h和72h，筛选LPS的浓度；实验组二：将0.4mM的棕榈酸分别按照200ng/mL+PA、400ng/mL+PA、800ng/mL+PA、1600ng/mL+PA加入L02细胞中，分别培养24h、48h和72h；B.按步骤A操作对L02细胞进行消化，计数，将L02细胞以4×10³个/孔的密度均匀接种于96孔培养板中，24h后，按实验组一、实验组二放入细胞培养箱继续培养24h、48h和72h；C.在分别培养24h、48h和72h后，每孔加入20μLMTT溶液，放入37℃、5％CO₂，饱和湿度的细胞培养箱中培养4h；D.培养结束后抽弃孔内液体，加入150μLDMSO，摇床摇匀15min；E.酶标仪波长570nm检测各孔OD值，计算细胞存活率；(2)Hoechst 33342荧光染色：A.将L02细胞按步骤(1)中的方法以密度为2×105个/孔接种于预先放有灭菌盖玻片的24孔细胞培养板中；B.24h后抽弃培养基，按照实验组二处理细胞24h；C.处理24h后抽弃培养基，每孔加入PBS1mL后置于摇床5min清洗两遍；D.清洗后每孔加入4％多聚甲醛溶液300μL，固定15min；E.当固定妥后，每孔加入浓度为10μg/mL的Hoechst 33342荧光染液500μL，避光条件下染色30min；F.然后每孔加入PBS1mL后置于摇床10min清洗三遍；G.清洗后将抗荧光淬灭剂封片，标记，荧光显微镜下观察；(3)油红O染色：A.按照实验组二处理L02细胞，细胞爬片、清洗和固定操作；B.然后将24孔细胞培养板置于摇床后，加入油红O染液每孔400μL，染色15‑20min，吸除染液，37‑40℃去离子水冲洗3‑4遍；C.清洗后每孔加入核染液400μL，染色1‑3min，吸弃，流水冲洗1min；D.冲洗后放到显微镜下初步观察，若有染料未洗净，重复流水冲洗3‑4遍；E.使用封片剂封片，置于显微镜下观察染色情况并记录；(4)游离脂肪酸测定：A.按照实验组二处理L02细胞，抽取实验各组培养液后置于离心管中，3500r/min离心5min后抽取各组上清200μL，在BCA试剂盒测定各组上清蛋白浓度；B.依次加入缓冲液500μL，铜试剂1mL，氯仿4mL后，充分混匀抽提2min；C.以3500r/min离心10min，吸弃上层蓝色液体及蛋白凝块后取2mL下层抽提液加入标记好的离心管；D.加入显色剂250μL，室温反应2min后在440nm波长下检测各组吸光度；E.根据公式计算各组游离脂肪酸含量。