[发明专利]寨卡病毒的纳米抗体及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及生物纳米材料技术领域，具体涉及寨卡病毒的纳米抗体及其制备方法和应用，利用寨卡病毒的病毒颗粒，免疫羊驼，然后通过克隆，再将克隆得到的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，经过亲和淘选的方式选择亲和力较高的，最后进行单克隆ELISA的鉴定，之后抗体的表达纯化，得到寨卡病毒的纳米抗体。本发明提供的寨卡病毒的纳米抗体，利用免疫羊驼，再结合噬菌体展示技术，得到纳米抗体，不仅能够在原核或真核系统中高表达，而且特异性强，亲和力高，更加适合寨卡病毒的特异性血清学检测。

主权项

1.寨卡病毒的纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备寨卡病毒颗粒：利用A549细胞系培养寨卡病毒，然后收集上清，通过密度梯度离心得到寨卡病毒颗粒，浓度为1mg/ml；2)羊驼免疫：首次免疫将1mg Zika抗原与CFA开乳化后，后皮下多点注射；其次加强免疫将0.5mg Zika抗原与IFA乳化后，后皮下多点注射；最终免疫将0.5mg Zika抗原与IFA乳化后，后皮下多点注射，之后进行血清学效价验证；3)目的片段克隆：首先分离血液中的外周淋巴细胞，然后进行RNA的提取，逆转率以及两轮的巢式PCR，最后将PCR产物连接到pComb3XSS噬菌粒载体上，之后进行电转化到大肠杆菌中，经测序验证正确后用于后面的相关筛选；4)亲和淘选：将靶分子Zika用pH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为10μg/mL，按100μL/孔加入酶标孔中，每个靶分子包被2孔，4℃包被12小时；弃包被液，PBS洗涤3次，每孔加入300μL3％BSA‑PBS封闭液，37℃封闭1h；PBS洗涤3次，加入100μL噬菌体文库，37℃孵育1h；吸出未结合的噬菌体，用PBST洗涤6次，PBS洗涤2次；加入100μL Gly‑HCl洗脱液，37℃孵育8min，洗脱特异性结合的噬菌体；将该洗脱液转移至1.5mL无菌离心管中，迅速用15μLTris‑HCl中和缓冲液中和；取10μL进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余洗脱物混合后进行扩增和纯化，用于下一轮亲和淘选，改变淘选条件，一共进行三轮筛选；5)淘选后的文库扩增：将淘选洗脱物与处于对数生长前期的E.coli TG1培养物20mL混匀，37℃，静置30min；加入1mL20％葡萄糖和4μL Amp+，37℃，180r/min振荡培养30min；按cell：phage＝1：20的比例加入M13K07噬菌体，37℃，静置30min后，补加20mL2×YT，37℃，180r/min振荡培养30min；将培养物分装于离心管中，25℃，5000r/min离心10min，细胞沉淀以50mL2×YT‑AK液体培养基重悬，30℃，230r/min振荡培养12小时；将培养物4℃，10000r/min离心20min，将上清转移至新离心管，加入1/5体积的PEG/NaCl，混匀后置于4℃中2h；4℃，10000r/min离心20min，去除上清，将沉淀重悬于1mL PBS中，加入1/5体积的PEG/NaCl，混匀后置于4℃中1h；4℃，10000r/min离心20min，去除上清，将沉淀悬浮于200μL PBS中，即得到纳米抗体。