[发明专利]一种单碱基突变方法及采用的系统在审
| 申请号： | 201910232476.0 | 申请日： | 2019-03-26 |
| 公开（公告）号： | CN109943589A | 公开（公告）日： | 2019-06-28 |
| 发明（设计）人： | 包煜贤 | 申请（专利权）人： | 广州鼓润医疗科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/90;C12N15/10 |
| 代理公司： | 苏州创元专利商标事务所有限公司 32103 | 代理人： | 汪青;周敏 |
| 地址： | 511458 广东省广州市南沙区丰泽*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | 本发明涉及一种单碱基突变方法及采用的系统，针对欲突变基因的点突变位点设计sgRNA并构建CRISPR/Cpf1质粒；截取欲突变成基因的突变点附近的碱基序列，并在碱基序列中引入无义突变合成donor1；将CRISPR/Cpf1质粒和donor1共转染含有欲突变基因的细胞得到含有无义突变的细胞；针对含有无义突变的细胞中的含有无义突变的序列的点突变位点设计Re‑sgRNA并构建Re‑CRISPR/Cpf1质粒；截取欲突变成基因的突变点附近的碱基序列合成donor2；将Re‑CRISPR/Cpf1质粒和donor2共转染含有无义突变的细胞得到含有欲突变成基因的细胞。本发明能够达到无痕修复的目的。 | ||
| 搜索关键词： | 无义突变 质粒 细胞 碱基序列 单碱基突变 突变基因 位点设计 点突变 共转染 突变点 截取 构建 基因 合成 无痕修复 引入 | ||
【主权项】：
1.一种单碱基突变方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)针对欲突变基因的点突变位点设计sgRNA；(2)将所述的sgRNA和CRISPR/Cpf1切割酶克隆到真核表达载体PX330上构建具有特异性靶向切割能力的CRISPR/Cpf1质粒；(3)截取欲突变成基因的突变点附近的碱基序列，并在所述的碱基序列中引入无义突变和对所述的碱基序列的5’和3’端的碱基进行硫代修饰，然后合成donor1；(4)将所述的CRISPR/Cpf1质粒和所述的donor1共转染含有欲突变基因的细胞，经克隆筛选后得到含有无义突变的细胞；(5)针对所述的含有无义突变的细胞中的含有无义突变的序列的点突变位点设计Re‑sgRNA；(6)将所述的Re‑sgRNA和CRISPR/Cpf1切割酶克隆到真核表达载体PX330上构建Re‑CRISPR/Cpf1质粒；(7)截取欲突变成基因的突变点附近的碱基序列，并对所述的碱基序列的5’和3’端的碱基进行硫代修饰，然后合成donor2；(8)将所述的Re‑CRISPR/Cpf1质粒和所述的donor2共转染所述的含有无义突变的细胞，得到含有欲突变成基因的细胞系。
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