[发明专利]一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法

摘要

本发明提供了一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞以及胰岛β细胞的方法。在由人多能干细胞来源的内胚层细胞向胰腺谱系细胞特化过程中，通过阶段性加入WNT信号通路抑制剂可以提高人多能干细胞向胰腺前体细胞分化效率。本发明在提高胰腺前体细胞分化效率后，进而提高成熟的胰岛β细胞分化效率。该方法适用于不同细胞系的胰腺分化，获得大量胰岛β细胞，为糖尿病细胞治疗、药物筛选、疾病模型等提供有力的支持，具有良好的应用前景。

主权项

1.一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，其特征在于：所述的方法步骤为：1)人多能干细胞分化为定型内胚层细胞：a.配制定型内胚层阶段培养基1，将人多能干细胞使用所述培养基于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养1天；b.配制定型内胚层阶段培养基2，将经过上述步骤a培养后的细胞更换为定型内胚层阶段培养基2，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养3天，每天更换培养基；所述定型内胚层阶段培养基1的组成为：以IMDM培养基和F12培养基以1:1比例混合做基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.2％牛血清白蛋白(BSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素‑A(Activin A)、50ng/ml Wnt3a蛋白，所述浓度均为终浓度；所述定型内胚层阶段培养基2的组成为：以IMDM培养基和F12培养基以1:1比例混合做基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.2％牛血清白蛋白(BSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素‑A(Activin A)，所述浓度均为终浓度；2)诱导定型内胚层细胞向胰腺前体细胞分化：配制胰腺前体细胞培养基，将经过步骤1)培养后的细胞，更换为胰腺前体细胞培养基，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；所述胰腺前体细胞培养基的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.5％牛血清白蛋白(BSA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、0.25M的维生素C、1×胰岛素‑转铁蛋白‑硒‑乙醇胺添加剂(ITS‑X)、50ng/ml成纤维细胞生长因子(KGF)、0.5μM SANT1(抑制剂靶点为smo)、100nM维甲酸(TTNPB)、500nM佛波醇12，13‑二丁酸酯(PDBu)、2μM ALK抑制剂(K02288)、WNT信号通路抑制剂，所述浓度均为终浓度；3)由胰腺前体细胞进一步分化获得胰岛β细胞：a.配制胰岛β细胞培养基1，将经过步骤2)培养后的细胞，更换为胰岛β细胞培养基1，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；b.配制胰岛β细胞培养基2，将经过上述步骤a胰岛β细胞培养基1培养后的细胞，更换为胰岛β细胞培养基2，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；所述胰岛β细胞培养基1的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：20mM的葡萄糖、2％牛血清白蛋白(BSA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、0.05mM维生素C、1×胰岛素‑转铁蛋白‑硒‑乙醇胺添加剂(ITS‑X)、2μM ALK抑制剂(K02288)、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM YO‑01027(Notch信号通路抑制剂)、10μM硫酸锌，所述浓度均为终浓度；所述胰岛β细胞培养基2的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：20mM的葡萄糖、2％牛血清白蛋白(BSA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、0.05mM维生素C、1×胰岛素‑转铁蛋白‑硒‑乙醇胺添加剂(ITS‑X)、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM Repsox(ALK5抑制剂)、10μM维生素E、10μg/ml肝素钠、2μM R428(Axl抑制剂)、10μM硫酸锌、10mM N‑乙酰‑L‑半胱氨酸(N‑cys)，所述浓度均为终浓度。