[发明专利]一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法有效
| 申请号： | 201910123831.0 | 申请日： | 2019-02-19 |
| 公开（公告）号： | CN110396527B | 公开（公告）日： | 2020-07-24 |
| 发明（设计）人： | 任明;刘建民;孙荣;张雷 | 申请（专利权）人： | 山东惠仕莱生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12P7/02 | 分类号： | C12P7/02 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 250100 山东省*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | 本发明提供一种以维生素D3为底物通过酶转化生产25‑羟基维生素D3的方法，该方法按如下步骤进行：a.发酵：产维生素D3羟化酶的大肠杆菌经IPTG诱导后培养18‑38h；b.破壁：发酵液通过离心收集大肠杆菌，并加入发酵液体积30%‑100%的纯水洗菌体，用磷酸盐缓冲液重悬菌体后通过高压均质机进行破壁处理；c.粗提：将b步骤获得的破壁液离心收集上清液，获得维生素D3羟化酶粗酶液；d.转化：用特定溶剂溶解维生素D3，加入到c步骤获得的粗酶液中，使得维生素D3的终浓度达到0.5‑5g/L，并加入该羟化酶的辅因子，于20‑40℃条件下，转化24‑48h。经HPLC检测，维生素D3的转化率达到80%以上。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 维生素 d3 羟化酶 转化 生产 25 羟基 方法 | ||
【主权项】：
1.一种维生素D3羟化酶转化生产25‑羟基维生素D3的方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：a.发酵：将产维生素D3羟化酶的基因工程菌接入发酵培养基（含10‑100mg/L氨苄青霉素），培养至OD600=1‑5时加入IPTG进行诱导产酶，其中IPTG的终浓度为0.1‑1mM，诱导温度为15‑30℃，发酵培养18‑38h得发酵液；b.破壁：发酵液通过5000‑10000rpm离心1‑5min，收集菌体，并加入发酵液体积30%‑100%的纯水洗菌体1‑3次，用磷酸盐缓冲液重悬菌体，菌液通过高压均质机进行机械破壁，获得细胞破壁液；c.粗提：将b步骤获得的破壁液6000‑12000rpm离心处理1‑10min，收集上清液，获得维生素D3羟化酶粗酶液；d.转化：用特定溶剂溶解维生素D3，缓慢加入到c步骤获得的粗酶液中，同时加入0.01%‑0.1%的维生素D3羟化酶的辅因子，在100‑500rpm震荡条件下进行游离酶转化。
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