[发明专利]一种人多能干细胞衰老模型的制备方法及其应用

摘要

本发明涉及生物医学技术领域，提供了一种人多能干细胞衰老模型的制备方法及其应用，人多能干细胞衰老模型的制备方法为将中国突变型HGPS病人来源的外周血单核细胞重编程为中国HGPS‑iPSC；使用CRISPR/Cas9和ssODNs介导的单核苷酸突变修复技术对LMNA的c.1579C>T(p.R527C)突变进行修复；并在体外将正常iPSC、中国HGPS‑iPSC和突变纠正iPSC分别分化为功能性MSCs，检测3种iPSC‑MSC中LMNA蛋白的表达、细胞增值、凋亡、细胞周期和细胞衰老等情况，由此揭示c.1579C>T(p.R527C)突变对细胞相关通路信号分子表达功能的影响，研究区别于高加索人群突变型HGPS的中国HGPS的分子机制和致病机理。

主权项

1.一种人多能干细胞衰老模型的制备方法，包括如下步骤：1)采集正常人和中国HGPS患者的外周血，体外分离并培养扩增原代外周血单核细胞PBMC；2)正常人iPSC和中国HGPS‑iPSC模型构建：包括PBMC体细胞重编程、iPSC克隆挑选和记录、iPSC的扩大培养和冻存；3)中国HGPS‑iPSC基因型鉴定和iPSC鉴定：包括HGPS‑iPSC基因型确认、分析LMNA蛋白的表达、iPSC的分子生物学鉴定；4)CRISPR/Cas9和ssODNs介导的基因编辑修复单位点突变：包括靶标于LMNA基因的gRNAs和ssODNs设计、sgRNA载体构建、CRISPR/sgRNA活性鉴定、突变纠正的iPSC产生、基因编辑的iPSC克隆挑选和扩增、基因编辑的iPSC克隆的冻存和基因型鉴定；5)诱导iPSC分化为间充质干细胞(iPSC‑MSC)以及表型鉴定：诱导正常iPSC、中国HGPS‑iPSC和突变纠正iPSC分化为MSCs、iPSC‑MSC鉴定；6)正常iPSC‑MSC、中国HGPS‑iPSC‑MSC和突变纠正iPSC‑MSC生物学特征分析：包括细胞衰老相关蛋白的表达、细胞增殖和凋亡情况、细胞功能稳定性检测、以及衰老涉及的基因和信号通路的研究。