[发明专利]一种树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法

摘要

本发明涉及一种树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法，属于细胞分离纯化技术领域。该方法利用胰蛋白酶与DNaseⅠ联合消化大脑皮层，通过两次差速贴壁纯化，较好的分离纯化树鼩OPCs。本发明方法操作步骤简单，具有细胞贴壁快、存活率高等特点，在后续的鉴定实验中呈现极高的细胞纯度，鉴定结果可信度高，可以满足医学、生物学、药学和生命科学各研究领域对树鼩OPCs相关实验研究的要求，适宜在一般实验室进行推广应用。

主权项

1.一种树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），少突胶质前体细胞分离：将1只新生48h内的树鼩离体大脑的大脑皮层剪碎成模糊状后加入3mL 0.25%胰蛋白酶和1mL 500~1000U/mL DNase Ⅰ联合消化，吹打成细胞混悬液，放入37℃、5% CO₂培养箱孵育5~10min；加入6mL混合培养液终止消化，吹打混匀，70目细胞筛网中过滤，滤液离心，弃上清，向沉淀中加入混合培养液重悬细胞沉淀，得到的细胞悬液接种于培养瓶，放入37℃、5% CO₂培养箱中培养1~2h，吸出细胞悬液接种于预先用PDL包被过的细胞培养瓶中，然后放入37℃、5% CO₂培养箱培养；所述的混合培养液为含10%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；所述的PDL包被过的细胞培养瓶是经下列操作制得：取1mL 0.1~0.5mg/mL PDL加入到细胞培养瓶中，摇匀铺满瓶底，静置5min，吸出液体并将细胞培养瓶放入37℃、5% CO₂培养箱过夜烘干，接种前用PBS润洗；步骤（2），少突胶质前体细胞增殖培养与纯化：培养5d后，去除原培养液后加入增殖培养液增殖培养，每天换液；增殖培养2d后，去除培养液，PBS清洗细胞以去除残留的增殖培养液，之后加入2mL分离液，并放入37℃、5% CO₂培养箱孵育10~15min，吹打细胞表面至成细胞混悬液，吸取细胞混悬液入40目细胞筛网中过滤一次，离心，弃上清，向沉淀中加入混合培养液重悬细胞沉淀，得到的细胞悬液接种于PDL包被过的培养板培养1~2min，之后吸取培养板上的细胞悬液到另一普通培养板中，放入37℃、5% CO₂培养箱中培养1~2h；吸出细胞悬液接种于PDL包被过的培养板中，然后放入37℃、5% CO₂培育箱过夜培养，之后将培养液更换为增殖培养液，继续培养；所述的增殖培养液为含10ng/mL bFGF、5ug/mL insulin、1%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；所述的分离液为含0.02%EDTA、5ug/mL insulin、0.5%DNase Ⅰ和1%双抗的DMEM/F12培养基；所述的混合培养液为含10%胎牛血清、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基；所述的PDL包被过的培养板是经下列操作制得：取1mL 0.1~0.5mg/mL PDL加入到培养板中，摇匀铺满培养板，静置5min，吸出液体并将培养板放入37℃、5% CO₂培养箱过夜烘干，接种前用PBS润洗；步骤（3），少突胶质前体细胞定向诱导分化：培养3天后，加入分化培养液定向分化，最后去除培养液终止培养；所述的分化培养液为含30ng/mL T3、10ng/mL CNTF、5ug/mL insulin、2%B27和1%双抗的DMEM/F12培养基。