[发明专利]重组人溶菌酶中毕赤酵母宿主蛋白残留量的检测方法

摘要

一种重组人溶菌酶原料中毕赤酵母宿主蛋白残留量的检测方法，由制备重组人溶菌酶、制备毕赤酵母宿主蛋白、检测毕赤酵母宿主蛋白的总蛋白含量、制备毕赤酵母宿主蛋白抗血清、消除重组人溶菌酶与毕赤酵母宿主蛋白免疫兔血清和毕赤酵母宿主蛋白免疫羊血清的交叉反应、毕赤酵母宿主蛋白双向电泳、检测毕赤酵母宿主蛋白的抗体覆盖率、酶联免疫检测步骤组成。采用本发明检测方法对重组人溶菌酶中的毕赤酵母宿主蛋白进行连续3批次检测，毕赤酵母宿主蛋白含量均0.05％，符合《中华人民共和国药典》规定的0.1％的标准。本发明检测方法具有特异性强、抗体覆盖率全、无交叉反应等优点，可用于毕赤酵母宿主蛋白的含量检测。

主权项

1.一种重组人溶菌酶原料中毕赤酵母宿主蛋白残留量的检测方法，其特征在于由下述步骤组成：(1)制备重组人溶菌酶pPIC9K‑hLYZ重组质粒电击转化毕赤酵母GS115菌株，筛选获得表达菌株，发酵诱导并纯化获得重组人溶菌酶；(2)制备毕赤酵母宿主蛋白pPIC9K空载体电击转化GS115菌株，筛选获得阳性菌株，发酵表达并按照步骤(1)中重组人溶菌酶的制备方法制备毕赤酵母宿主蛋白；(3)检测毕赤酵母宿主蛋白的总蛋白含量采用双缩脲法检测步骤(2)的毕赤酵母宿主蛋白的总蛋白含量；(4)制备毕赤酵母宿主蛋白抗血清采集兔血清和羊血清分别作为对照，以毕赤酵母宿主蛋白为抗原分别免疫新西兰大白兔和山羊，免疫一个月后采血，获取毕赤酵母宿主蛋白免疫兔血清、毕赤酵母宿主蛋白免疫羊血清；(5)消除重组人溶菌酶与毕赤酵母宿主蛋白免疫兔血清和毕赤酵母宿主蛋白免疫羊血清的交叉反应1)制备多克隆抗体取兔血清与0.06mol·L^‑1pH4.8的醋酸钠缓冲液、正辛酸按体积比为1：2：0.02～0.05混合，离心10000转/分钟离心，取上清；用1mol·L^‑1NaOH溶液调pH至7.4，加入质量浓度为40％的硫酸铵溶液至蛋白析出，离心取沉淀，加入磷酸盐缓冲液至沉淀溶解，用0.1mol·L^‑1pH为7.4的磷酸盐缓冲液透析，制备成透析兔血清；配制A缓冲液：取十二水合磷酸氢二钠与二水合磷酸二氢钠、氯化钠按摩尔比为1：1：2混合，加双蒸水至溶解，磷酸调pH至7.0，加蒸馏水定容；配制B缓冲液：按照常规方法配制成pH为3.7的50mmol·L^‑1乙酸‑乙酸钠缓冲液；取透析兔血清与50mmol·L^‑1磷酸盐缓冲液按照体积比为1：4混合，0.22um过滤，上HiTrap^TMrProtein A FF，HiTrap^TMrProtein G HP抗体亲和层析柱，用A缓冲液平衡20个柱体积，上样，再用A缓冲液平衡20个柱体积，用B缓冲液洗脱，收集洗脱峰，制备成兔多克隆抗体；按照制备兔抗多克隆抗体的方法制备羊多克隆抗体；2)预处理重组人溶菌酶配制质量浓度为1mg/mL的重组人溶菌酶水溶液，甲基绿、α‑丙氨酸或β‑丙氨酸、甘油加入容量瓶，加入去离子水溶解，甲基绿与α‑丙氨酸或β‑丙氨酸、甘油的质量比为1：8～12：200，用醋酸调pH至4.5～5.0，加入去离子水定容，制备成缓冲液，取缓冲液与重组人溶菌酶水溶液以1：3～5的体积比混合，8000～10000转/离心，取上清上样；3)检测重组人溶菌酶与多克隆抗体交叉反应配制25mmol·L^‑1氢氧化钾溶液，用醋酸调pH至4.0～4.5，制备成5×分离胶缓冲液；配制20mmol·L^‑1氢氧化钾溶液，用醋酸调pH至6.6～6.8，制备成5×浓缩胶缓冲液；配制80mmol·L^‑1α‑丙氨酸或β‑丙氨酸溶液，用醋酸调pH至4.5～5.0，制备成1×电泳缓冲液；取N,N,N,’N’‑四甲基乙二胺与质量浓度为10％的过硫酸铵、5×分离胶缓冲液、质量浓度为30％丙烯酰胺溶液、双蒸水按体积比为1：30：80：132：184混合，配制质量浓度为10％的分离胶，灌胶聚合30min；取N,N,N,’N’‑四甲基乙二胺与质量浓度为10％的过硫酸铵、5×分离胶缓冲液、质量浓度为30％丙烯酰胺溶液、双蒸水按体积比为1：30：80：67：249混合，配制成质量浓度为5％的浓缩胶，灌胶聚合30min；将预处理的重组人溶菌酶溶液上样电泳，电转移聚偏氟乙烯膜，多克隆抗体与Tris‑盐酸缓冲液按照体积比1：2000～100000稀释为一抗，室温孵育2h，用带有辣根过氧化物酶标记的二抗与Tris‑盐酸缓冲液按照体积比1：10000～40000稀释，室温孵育1h，化学发光显色并上机成像，消除了重组人溶菌酶与毕赤酵母宿主蛋白免疫兔血清和毕赤酵母宿主蛋白免疫羊血清的交叉反应；(6)毕赤酵母宿主蛋白双向电泳配制质量浓度为10mg/mL的毕赤酵母宿主蛋白水溶液，进行第一向等电聚焦电泳，再进行第二向丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，取下凝胶上化学发光成像仪成像，PDQuest软件计算蛋白点数，即为毕赤酵母宿主蛋白点数；(7)检测毕赤酵母宿主蛋白的抗体覆盖率取毕赤酵母宿主蛋白双向电泳凝胶进行免疫印迹检测，电转移聚偏氟乙烯膜，多克隆抗体做为一抗孵育聚偏氟乙烯膜，再用带有辣根过氧化物酶标记的二抗孵育聚偏氟乙烯膜，化学发光显色并上机成像，PDQuest软件计算显色的蛋白点数，即为抗体覆盖率显色点数，用抗体覆盖率显色点数除以毕赤酵母宿主蛋白点数，结果为抗体覆盖率；(8)酶联免疫检测包被羊多克隆抗体于96孔板中4℃冰箱过夜，37℃孵育箱封闭2小时，加毕赤酵母宿主蛋白37℃孵育箱孵育1小时，加兔多克隆抗体37℃孵育箱孵育1小时，加入辣根过氧化物酶标记的二抗37℃孵育箱孵育1小时，用3,3',5,5'‑四甲基联苯胺显色，用2mol·L^‑1的硫酸溶液终止反应，检测450nm吸光度值；设定毕赤酵母宿主蛋白的浓度梯度为100ng·mL^‑1、200ng·mL^‑1、400ng·mL^‑1、600ng·mL^‑1、800ng·mL^‑1、1000ng·mL^‑1，用吸光度值对毕赤酵母宿主蛋白浓度做标准曲线，采用酶联免疫法检测重组人溶菌酶冻干粉原料中的毕赤酵母宿主蛋白含量。