[发明专利]一种增强放线菌基因编辑效率的方法及其应用

摘要

本发明提供一种增强放线菌基因编辑效率的方法及其应用，是以删除天蓝色链霉菌中的actII‑ORF4为例，利用诱导型启动子tipAp、核糖体开关以及split Cas9控制Cas9活性，转化过程相比于传统的组成型Cas9表达，转化效率提高约260倍；编辑过程添加诱导物并提高ATP浓度，使编辑效率达到80％。本发明方法建立一个既能受到化学小分子诱导，又能受蓝光可逆调控的CRISPR/Cas9系统，从而保证在质粒转化效率和目的宿主正常生长代谢最大限度不受影响的情况下，实现基于双链断裂的精确高效基因编辑，本发明应用于包含链霉菌在内的其它模式或工业放线菌的基因工程和遗传修饰改造。

主权项

1.一种增强放线菌基因编辑效率的方法，其特征在于，所述方法通过以下步骤实现：(1)根据目的宿主生理特性挑选合适的诱导型启动子、强启动子和骨架质粒；(2)将步骤(1)筛选的诱导型启动子、核糖体开关、split Cas9以及强启动子‑atpD高供能基因盒插入到步骤(1)所选骨架质粒中；(3)设计目的编辑位点的间隔序列(左臂加右臂)，分别插入步骤(2)所构质粒，用于引导Cas9蛋白向靶序列移动；(4)根据宿主生理性质和质粒元件，选取合适的筛选转化子的抗生素或营养缺陷型等筛选方式，也在步骤(3)构建的质粒中另外添加表达抗生素和营养缺陷型等的相关基因；(5)在非诱导条件下，将步骤(4)中的重组质粒转化进入目的宿主中，通过添加筛选条件的培养基筛选，筛选得到携带重组质粒的转化子；(6)将步骤(5)中的转化子接种带有合适筛选条件的富集培养基，恒温发酵；(7)取步骤(6)中发酵24h–48h的发酵液，离心收取菌体，用无菌水清洗两次，离心弃上清，更换添加合适浓度启动子诱导条件和茶碱的培养基，随后在蓝光诱导条件下摇床恒温培养；(8)取(7)中发酵液离心，弃上清，收集的沉淀就是完成目的基因编辑的菌株。