[发明专利]用于治疗卵巢早衰的胎盘间充质干细胞制剂

摘要

本发明涉及用于治疗卵巢早衰的胎盘间充质干细胞制剂。具体地说，本发明一方面提供了从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法；另一方面，本发明提供了一种细胞制剂，其是通过使间充质干细胞(例如胎盘间充质干细胞)混悬于0.9％氯化钠溶液中配制成的细胞混悬液。该细胞制剂可以用于治疗卵巢早衰，特别是该细胞制剂是胎盘间充质干细胞制剂。本发明细胞制剂是通过包括方法制得的：将细胞传代所得间充质干细胞转移至离心管中，离心，弃上清，加入0.9％氯化钠溶液重悬，制得细胞制剂。本发明细胞制剂在治疗卵巢早衰方面呈现优异的生物学效果。

主权项

1.从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：(1)胎盘小叶的处理：将胎盘置于白瓷盘中，用组织清洗液冲洗以去除胎盘瘀血，剪取20g胎盘小叶组织于钢杯中，使用组织清洗液清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g较好的组织于100mm玻璃皿中；加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm³左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再反复此操作以用组织清洗液清洗两次从而除去血细胞；(2)混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入37℃预热的15～30ml(例如20～25ml，例如23ml)混合酶消化液中充分混匀后，摇床37℃、100rpm振荡消化30min，消化结束后，向组织液中添加2ml的FBS以终止消化；(3)收集原代细胞：向上一步骤所得组织液中添加50ml组织清洗液，混匀，300目过滤，收集细胞液；如此反复两次洗涤消化后的组织，两次的滤液合并至离心管中，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，细胞沉淀加DMEM‑F12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的DMEM‑F12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；(4)原代细胞冻存：使细胞悬液1800rpm，离心10min(加速度9，减速度7)，留取细胞沉淀及下液5ml，重悬后缓缓加入冻存液10ml，边加边摇匀；将所得细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml，置预冷的程序降温盒中，使用程序降温仪器程序降温，再将细胞转入液氮存储罐中冻存；(5)细胞复苏：取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；接着1200rpm离心5min(加速度9，减速度7)后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个T75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养；每隔3‑4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm²时可进行接下来的传代；(6)细胞传代：取P0代细胞用PBS清洗，加2ml胰酶消化2‑5min，直至细胞大部分脱落，加5ml完全培养基终止消化，使细胞转移至离心管中，1400rpm离心5min(加速度9，减速度7)，弃上清，加5ml完全培养基重悬后计数接种至培养瓶，细胞密度为8000～12000个细胞/cm²，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养至细胞密度达90％以上(通常培养5天左右)，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代、P3代至P4代、P4代至P5代的细胞传代，得到各代间充质干细胞，该方法还任选的包括如下步骤：(7)针对步骤(6)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA‑ABC/DR配型；(8)将步骤(6)所得传代后的各代胎盘间充质干细胞于液氮中冻存；(9)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(8)的冻存细胞进行关联。