[发明专利]一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法

摘要

一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法，本发明属于蛋白质在植物细胞中的定位方法领域，具体涉及蛋白质在植物保卫细胞中的定位方法领域。本发明的目的是为了解决传统方法进行蛋白质亚细胞定位的周期较长、操作复杂等问题。本发明的快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法为：一、植物表达载体的构建，二、植物叶片保卫细胞的分离，三、保卫细胞的转化，四、保卫细胞孵育培养，五、保卫细胞中蛋白质的定位。本发明提供的方法用于蛋白质在植物保卫细胞中的定位。

主权项

1.一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法，其特征在于：该方法按以下步骤进行：一、植物表达载体的构建：利用高保真酶pfu系列，根据NCBI中primer blast设计目的基因的引物，以提取植物材料RNA并反转生成的cDNA为模板，通过PCR技术将目的基因克隆并测序；将表达载体和基因片段用相同的内切酶消化回收后，通过连接酶将基因片段连接至表达载体pBI121‑EGFP上，然后制备目的基因表达载体质粒；所述目的基因表达载体质粒为在pBI121‑GUS基础上将GUS基因切除替换成EGFP基因而获得的载体，以CaMV 35S为启动子，用增强型绿色荧光蛋白标记目的蛋白为读码框，并以NOS为终止子的双元表达载体构建得到植物表达载体；二、植物叶片保卫细胞的分离：在超净工作台中向圆皿里加入20‑30mL酶解液，取叶片置于酶解液中剪碎，用封口膜封闭并用锡纸包裹进行酶解，酶解条件为温度22‑25℃，摇床转速为30‑40rpm，酶解时间4‑5h；取干净圆皿，将酶解液过滤，并置于50mL提前4度预冷的离心管中；向过滤得到的液体中添加10‑20mL洗涤液，4℃，离心机转速为100g，离心3‑5min，去除上清液，得到分离开的保卫细胞；三、保卫细胞的转化：将步骤二得到分离开的保卫细胞用1‑2mL悬浮液悬浮，即得到含有保卫细胞的液体；在离心管中依次加入20‑30μL步骤一得到的植物表达载体、200‑300μL含有保卫细胞的液体、200‑300μL PEG介导液，常温下静置20‑30min，得到转化后的保卫细胞；四、保卫细胞孵育培养：将转化后的保卫细胞加入500‑700μL洗涤液，常温，离心机转速为100g，离心1‑2min，去除上清液；向得到的沉淀加入700μL‑1mL孵育液，悬浮培养保卫细胞，22‑25℃培养16‑20h；五、保卫细胞中蛋白质的定位：吸取20‑30μL步骤四悬浮培养的细胞液滴在载玻片上，压片结束后直接在激光共聚焦显微镜下进行检测，在保卫细胞中的蛋白质即可发射荧光，即得到本发明的蛋白质在植物叶片保卫细胞中的位置。