[发明专利]凡纳滨对虾高血糖激素间接竞争酶联免疫检测方法

摘要

凡纳滨对虾高血糖激素间接竞争酶联免疫检测方法，首先以原核表达方式于大肠杆菌中获得凡纳滨对虾重组高血糖激素，然后以rLvCHH为免疫抗原，利用现有的多克隆抗体的制备与纯化技术获得抗rLvCHH多克隆抗体，该抗体可与CHH特异性结合，建立了一种凡纳滨对虾高血糖激素的间接竞争酶联免疫检测方法，为检测凡纳滨对虾机体组织中的CHH含量提供了一种快速高效的检测手段。甲壳动物高血糖素是甲壳动物特有的神经内分泌激素，具有血糖调节、渗透调节等功能。要深入解析CHH，其定量测定十分重要。酶联免疫检测方法具有特异性强等特点，通过抗原‑抗体能够较为准确的定量目的蛋白，从而利于深入解析CHH的功能。

主权项

1.一种凡纳滨对虾高血糖激素间接竞争酶联免疫检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）用凡纳滨对虾重组高血糖激素合成人工抗原：构建重组质粒并转化到大肠杆菌中：根据本实验室之前克隆的LvCHH基因cDNA序列（GenBank登录号：HM748790.2）的开放阅读框以及表达载体pET‑32a (+)的多克隆位点的序列来设计特异性引物，选择xhol I和BamH I两个限制性内切酶，设计了一对特异性原核表达引物LvCHHxhol I和LvCHHBamH I，进而构建并鉴定重组质粒 p32a‑LvCHH；通过T4 DNA 连接酶来连接上述特异性原核表达引物和线性载体 pET‑32a，连接后的载体转化到大肠杆菌 DH5α中，得到重组菌以待进一步转化；LvCHH 基因的诱导表达：将重组质粒 p32a‑LvCHH 转化到大肠杆菌 BL21；重组菌扩大培养和诱导表达：当上述待转化的重组菌的单菌落长到菌落直径约为1‑2mm时，从培养皿中挑取单菌落于LB 液体培养基中，培养基含有 50μg/ml 的 Amp，在振荡器中，37℃，200 rmp/min 震荡过夜培养，之后扩培至 OD600 为 0.6 ，扩培比例为 1：100，然后加入诱导剂IPTG，使诱导剂浓度为 1mmol/L，阴性对照为不加诱导剂 IPTG 的菌株；重组蛋白的提取与分离：室温条件下，4000 g离心 10 min 收集步骤（1）得到的菌体，重悬在 3 ml 裂解液 1（Na2HPO40.358g，NaH2PO40.156g, Nacl 2.922g，2M 咪唑 1ml 定容至 100ml，调 pH 值到 7.4，0.45μm 滤膜过滤）中；超声波破碎细胞，每管至少破碎 10min，每隔 10s 停顿一次，以免发热对蛋白的活性造成影响；4℃温度下 10000 g 离心 20 min，此时可溶性蛋白存在于上清液中，沉淀中包含有以包涵体形式存在的蛋白；将上清液倒入新的离心管中并做好标记，不溶性的包涵体蛋白重悬在裂解2（Tris 0.2425g，尿素 48.05g，Nacl 2.922g，2mol/L 咪唑 1ml，用超纯水溶解，调 pH 值到 8.0，0.45μm 滤膜过滤，加 β‑巯基乙醇，定容到 100ml），37℃震荡孵育 45min，4℃温度下 10000 g 离心 20 min，取上清液，则包涵体形式的蛋白存在于上清液中；经检测，rLvCHH更多的存在于上清液中的可溶性蛋白中：用His 标签纯化上述存在于上清液中的可溶性蛋白：剪掉纯化柱底部的尖，去掉顶部的盖，倒掉多余的液体，将纯化柱放在架子上；用 10 ml 裂解液 1 平衡柱子，紧接着进行填料防止柱子流干；加样 3 ml，用 10 ml 裂解液 1 洗涤柱子；加入 3 ml 洗脱缓冲液（Na2HPO40.358g，NaH2PO40.156g, Nacl 2.922g，2M咪唑 25ml 定容至 100ml，调 pH 值到 7.4，0.45μm 滤膜过滤）洗脱，收集洗脱液，洗脱蛋白于 4℃保存；最后再通过冷冻干燥蛋白的方法，升华水分，得到浓缩蛋白晶体，即凡纳滨对虾重组高血糖激素（rLvCHH）人工抗原；2）rLvCHH多克隆抗体的制备步骤：以浓度为100ug/mL的rLvCHH作为抗原，利用现有的多克隆抗体的制备与纯化技术获得抗rLvCHH多克隆抗体，该抗体可与高血糖激素特异性结合；3）间接竞争ELISA检测步骤：以pH6.4的磷酸盐缓冲液溶解步骤1）最终得到的浓缩蛋白晶体并包被该人工抗原至100 µg/mL，将包被抗原加入酶标板中，每孔100 µL，置于4℃冰箱内孵育过夜；将孵育过夜后的酶标板甩干液体，然后加入200 µL/孔洗涤液洗涤3次后，加入封闭液，37℃封闭2h；再将步骤1）得到的浓缩蛋白晶体溶解，并逐级稀释成7个梯度，将逐级稀释成7个梯度的溶液、以及作为待测样品的凡纳滨对虾身体组织，分别加入到各自的酶标孔中，每孔加100 µL；同时分别以抗体稀释液1：400的比例稀释步骤2）得到的多克隆抗体，并加入以上各个酶标孔中，每孔100 µL；37℃孵育30‑60 min后以PBST洗涤3次；以抗体稀释液1:2500的比例稀释辣根过氧物酶标记的兔抗大鼠IgG，然后加入以上各个酶标孔中，每孔100µL，37℃孵育30‑60 min后以PBST洗涤3次；将四甲基联苯胺显色液A液和B液1:1混合后加入以上各个酶标孔中，每孔100 µL，37℃显色20 min；将2mol/L硫酸溶液加入以上各个酶标孔中终止反应，每孔50 µL；用酶标仪在450 nm波长下测吸光值OD450，得到rLvCHH纯化蛋白溶液的标准曲线，以及待测样品的吸光值，将所得的待测样品的吸光值与所做标准曲线对比即比算出待测样品中CHH含量。