[发明专利]一种快速检测四种硝基呋喃代谢物的免疫层析法

摘要

本发明涉及一种快速检测四种硝基呋喃代谢物的免疫层析法。在本发明中，羊抗鼠IgG标记的铕（III）纳米粒子偶联物作为一种通用的平台，可以介导多重抗体的标记，提高标记特异性和效率。以AHD、AOZ、SEM和AMOZ为例，本发明涉及一种同时检测四种呋喃代谢物的多重荧光试纸条检测方法，并将这种纸传感器的应用于鱼肉样品的检测。结果表明在10分钟内同时对其进行肉眼检测，其消线值分别为0.1，0.5，0.5和0.5ng/g。简而言之，本发明中开发的这种免疫测定方法是检测饲料或食品动物样品中硝基呋喃代谢物的有效工具。

主权项

1.一种快速检测四种硝基呋喃代谢物的免疫层析法，其特征如下，具体步骤如下：（1）单克隆抗体mAb的表征：首先，通过用于96孔板的棋盘试验获得CPAHD‑OVA和AHD‑mAb的最佳工作浓度；然后，在该工作点建立2‑NPAHD的竞争抑制曲线，并拟合四参数逻辑方程以获得2‑NPAHD的IC50；（2）Eu纳米球抗体偶联物的制备：首先，用50mM pH值6.0的MES缓冲液将100μL Eu纳米球稀释至1mL并超声处理；随后，将10μL 2mg/ml的NHS溶液和10μL 1mg/ml的EDC溶液加入混合物中并搅拌30分钟；接下来，将100μg羊抗鼠IgG二抗溶液和100μLCBS缓冲液加入到NHS活化溶液中，将混合物在室温下孵育2小时，并用40μL 4％BSA溶液封闭；然后，将混合物离心15分钟，将沉淀物悬浮在1mL PBST中并超声处理1分钟；最后，在室温下将50μg AHD‑mAb加入溶液中孵育2小时，将混合物离心15分钟；除去上清液，将沉淀重悬于1mL硼酸缓冲液中并超声处理以备进一步使用；将AOZ‑mAb，SEM‑mAb和AMOZ‑mAb按上述相同的程序标记；（3）羊抗鼠二抗介导铕（III）纳米粒子免疫层析法的建立：铕（III）纳米粒子免疫试纸条是将NC膜，样品垫和吸收垫逐层粘贴到PVC粘合剂卡上制成的；分别将CPSEM‑OVA，CPAMOZ‑OVA，CPAOZ‑OVA，CPAHD‑OVA和羊抗鼠IgG喷到NC膜上，T线1，T线2，T线3，T线4和C线彼此间隔3.8mm；然后，将组装好的卡在37℃下干燥6小时；最后，将条带卡切成3.9mm宽的条带，并在室温下储存在干燥的箱子中。