[发明专利]一种基于斑马鱼激素水平响应的水环境内分泌干扰效应评价方法

摘要

本发明公开了一种基于斑马鱼激素水平响应的水环境内分泌干扰效应评价方法。本发明首先进行斑马鱼暴露实验，然后通过液质联用技术同时定量分析斑马鱼体内多种蛋白生物标志物，再以斑马鱼蛋白响应指数对生物标志物响应进行统一量化，从而确定暴露水体的健康风险等级和程度。本发明通过测定水环境介质暴露下斑马鱼体内的多种激素的差异表达，并将各激素生物标志物量化整合成斑马鱼激素响应指数以定量地表征水环境的内分泌干扰效应。

主权项

1.一种基于斑马鱼激素水平响应的水环境内分泌干扰效应评价方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)斑马鱼暴露实验：斑马鱼暴露实验在恒温且恒光照的条件下进行，所述恒温温度为27.5℃‑29.5℃，所述恒光照的光、暗时间每天分别为14h和10h。暴露分为对照组和实验组，每组放置成年斑马鱼雌雄各10条，且雌雄分开暴露于装置内。暴露期间，每天喂食一次，并更换装置内一半的水。暴露结束后，对每条鱼称重后各加1mL超纯水进行匀浆。匀浆液用离心机2500×g离心10min后，取上清液保存于‑80℃冰箱内待分析。(2)液质联用技术同时定量分析斑马鱼体内多种蛋白生物标志物：分析用的是2.1mm×50mm、1.7μm的Waters BEH C18柱，并在前端串联一根VanGuardTM保护柱，所述VanGuardTM保护柱为2.1mm×50mm、1.7μm的C18柱。流动相用二元洗脱液，A路水，B路乙腈，均添加体积浓度为0.1％的氨水，流速为0.3mL/min，进样量为10μL。设置的梯度是：0min，5％B；4min，25％B；8min，95％B；10min，5％B，所述比例均为体积比。质谱使用选择反应监测模式。毛细管电压为1.07kV。氮气用作脱溶剂气，气体的温度和流速分别为为350℃和800L/h。氩气为碰撞气。通过分析测定，得到下表所示的每种蛋白生物标志物的浓度。(3)以斑马鱼激素响应指数对生物标志物响应进行统一量化：将斑马鱼体内类固醇类激素、氨基酸衍生物类激素、脂肪酸衍生物类激素等多种激素的差异表达进行整合，形成斑马鱼激素响应指数。斑马鱼激素响应指数Z_HIBR的计算具体为：计算每种激素生物标志物重复样的平均值X，令Y＝(X‑m)/s，其中m和s分别为每种激素生物标志物所有实验水平下的总体平均值和标准偏差。当生物标志物的响应为激活时，令Z＝Y；当生物标志物的响应为抑制时，令Z＝‑Y。取所有实验水平下Z值最小值Min，将其绝对值与Z相加得到每种生物标志物的得分S，S＝Z+|Min|。利用星状图表示生物标志物的结果，每种生物标志物的S值以星状图中辐射线长度表示，水环境的IBR值通过计算星状图面积即相邻生物标志物的辐射线所围成的三角形面积之和获得。A_i为第i个和第i+1个辐射线形成的三角形面积，可通过下式计算：其中，α是相邻两条辐射线的夹角，n是测定的生物标志物的个数，总面积即为斑马鱼激素响应指数，各暴露组的斑马鱼激素响应指数与对照组比较以确定暴露水体的内分泌干扰效应等级和程度。