[发明专利]一种超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的方法

摘要

本发明公开了一种超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的方法。结合超支化一锅法滚环扩增反应和无标记荧光检测，建立了一种灵敏度高和特异性好的单核苷酸多态性检测方法。方法利用了特异性的连接反应和强有力的目标DNA引导的支化滚环扩增反应，在一锅法的基础上引入第二引物，其能通过一锅法超支化滚环扩增反应进行有效的扩增并产生了不同长度的DNA产物，随后加入高灵敏的SYBR Green I染料进行荧光测量，提高了一锅法滚环扩增的灵敏度，方法可用于单核苷酸多态性的快速定量检测。

主权项

1.一种超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于具体步骤为：（1）将1 µL浓度为1 μmol/L的锁式探针、1 µL浓度为10mmol/L的四种脱氧核糖核苷三磷酸的混合物即dNTPs，1μL浓度为4μmol/L 的第二引物即2nd primer和7µL的焦碳酸二乙酯处理的蒸馏水即DEPC水混合组成10µL的A预混液，再将2 µL 10×Taq DNA 连接酶缓冲液、2 µL 10× phi29 DNA 聚合酶缓冲液、1 µL浓度为10 nmol/L的待测靶序列、0.5 µL 40U/ µL的Taq DNA连接酶、0.5 µL 10U/ µL的phi29 DNA聚合酶以及4 µL DEPC水混合组成10 µL的 B预混液，然后将A预混液和B预混液混合均匀，用移液枪吹打均匀，以上操作均在冰面上进行，然后置于30℃下反应6 小时，于65℃下10 分钟使酶失活以终止扩增反应；（2）单核苷酸多态性的分型测定：取步骤（1）中的扩增产物5μL、1μL 6×Loading Buffer和0.6μL 100×Syber GreenⅠ工作液，室温放置5分钟，灌胶后点样到质量百分比浓度为1%的琼脂糖凝胶中，跑胶时用1×TBE缓冲液即0.04 mol/L Tris‑硼酸，0.001 mol/L EDTA，pH=8.0的溶液，在100V电压下跑胶40分钟，在凝胶成像仪下成像，保存图片；（3）单核苷酸多态性荧光检测：取步骤（1）中的扩增产物2 μL、2 μL 20×Syber GreenⅠ溶液，用pH7.4 10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液溶液稀释到100 μL，室温下保持10‑15分钟，用350 μL的微量比色皿测定，荧光测量时选择激发波长为495 nm，光谱记录范围从505 nm到700 nm，在534 nm处测定其荧光信号强度。