[发明专利]一种种牛性控精液低温保存方法

摘要

本发明属于牛冻精生产技术领域，具体涉及一种种牛性控精液低温保存方法：包括如下步骤：采集、检测、过滤、加抗生素、染色、水浴、加egg yolk、甘油乳化、精子沉淀物的悬混、计数、加样、灌装、冷冻、抽检、液氮保存，在牛冻精生产中，鲜精接入后先置于33℃水浴锅内，经过初步检测后直接置于19℃环境中最后放入低温操作柜内降温平衡后，封装打印,通过这一步骤，可以有效地使精子逐步适应下降的温度，减缓能量损失，减少死亡。

主权项

1.一种种牛性控精液低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)采集：采集成熟度好的牛精液，放入33℃水浴锅中备用；步骤(2)检测：对步骤(1)采集的精液进行品质检测，要求活力≥0.65、密度≥8亿/m，保留合格精液，弃掉不合格精液；步骤(3)过滤：将步骤(2)检测合格的精液用过滤筛过滤掉杂质，滤液转移至15ml离心管中，过滤操作在室温19℃下进行；步骤(4)加抗生素：原精转移至离心管后第一时间加入混合抗生素css，摇匀后放入19℃的恒温箱中，备用；步骤(5)染色：原精取回前将Staining液放入33℃的水浴锅中预热；按照用量取用步骤(4)加有抗生素的精液，并向精液中加入Staining液和荧光染料HO33342；步骤(6)水浴：将步骤(5)所得的染色后的精液放入37℃水浴锅内暗室水浴48分钟；步骤(7)加egg yolk：将步骤(6)的精液从水浴锅中取出，并向精液中加入终浓度的为4％的egg yolk，摇匀后经过50微米过滤器过滤至5ml上样管内，用流式细胞仪使X、Y精子分离，将X或Y精子置于冰箱中平衡，平衡后离心，弃上清液，收集沉淀X或Y精子，将沉淀的X或Y精子置于4℃冷却室中保存，备用；步骤(8)甘油乳化：将沉淀的X精子或Y精子置于离心机的离心管中，离心机的温度参数为4℃，向离心管中加入甘油，用于乳化X精子或Y精子；将乳化后的X精子或Y精子置于离心机中，离心时长控制在20分钟，离心后，弃上清液，用4℃隔离冷却器将含X精子或Y精子的离心管运回4℃冷却室；步骤(9)精子沉淀物的悬混在4℃条件下将留下的精子沉淀物悬混，混悬时长为15秒；将悬混后的精子沉淀物收集到已称重的离心管中；步骤(10)计数采用血细胞计数板计数法对步骤(9)的精子沉淀物进行取样计数；步骤(11)加样向步骤(9)悬混后的精子沉淀物中依次加入Tris A和Tris B，摇匀后灌装、冷冻，冷冻结束后抽检，抽检合格移入液氮罐中保存，备用。