[发明专利]一种利用MsPALM1 人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法

摘要

本发明提供一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，首先在紫花苜蓿复叶发育调控基因MsPALM1外显子区选取靶标片段并构建植物CRISPR/Cas9打靶重组载体MsCRISPR/Cas9::PALM1，导入紫花苜蓿细胞并再生成苗，通过剪切后修复造成紫花苜蓿细胞MsPALM1基因出现功能缺失突变，再通过对再生株系基因组目标片段的限制性内切酶酶切和/或靶点深度测序筛选突变植株，获取携带四个等位MsPALM1基因同时发生功能缺失突变的株系，经过表型鉴定，确认再生植株复叶由三片小叶转为五片小叶。实验表明，本方法可快速获得多叶型紫花苜蓿材料，育种周期短，所获材料除变为五出羽状复叶之外其他农艺性状不变，性状稳定，可快速获得四个等位基因均突变的可稳定遗传的纯合突变体。

主权项

1.一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤(1)在紫花苜蓿复叶发育调控基因MsPALM1外显子区设计靶序列；其中，所述靶序列的双链结构中的一条链具有NGG结构，其中N代表碱基A、T、C、G中的任意一种；步骤(2)按照靶序列的核苷酸排列顺序，构建用于紫花苜蓿MsPALM1基因打靶的由根癌农杆菌介导转化的双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1，所述双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1包含sgRNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述sgRNA表达框包含所述MsPALM1靶标片段；步骤(3)将所述双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1通过根癌农杆菌转化导入紫花苜蓿细胞，使所述sgRNA表达框和所述Cas9核酸酶表达框在紫花苜蓿细胞中共同表达，剪切MsPALM1基因的双链的所述靶标片段，诱发所述紫花苜蓿细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现细胞内MsPALM1基因的功能缺失突变；步骤(4)，用步骤3中所述的紫花苜蓿细胞再生植株；步骤(5)，将步骤4中所得的再生植株中MsPALM1基因包含靶标片段的DNA区段进行PCR扩增后，使用限制性内切酶酶切检测和/或靶点深度测序检测；步骤(6)，选择四个等位基因都出现功能缺失突变的再生植株，进行表型鉴定，观察所述再生植株的复叶表型，挑取所有复叶完全表现多于3个小叶的植株，作为所创制的多叶型紫花苜蓿材料。