[发明专利]一种可诱导干细胞软骨分化的双模板分子印迹高强度水凝胶的制备方法

摘要

针对干细胞不易在水凝胶表面粘附增殖、生长因子易突释失活、组织工程支架难以持续诱导软骨分化等问题，本发明以纤维连接蛋白(FN)和转化生长因子‑β3(TGF‑β3)为模板，以丙烯酰胺和海藻酸钠为功能单体，N，N’‑亚甲基双丙烯酰胺和氯化钙为交联剂，制备促进干细胞粘附、增殖和软骨分化的双模板分子印迹聚丙烯酰胺/海藻酸钙/硅酸钙@SiO₂高强度水凝胶。通过FN模板构建的印迹孔穴和位点吸附更多的FN促进干细胞粘附和增殖；以TGF‑β3模板构建的印迹孔穴和位点结合TGF‑β3后，实现TGF‑β3的缓释，保护其活性并促进干细胞软骨分化。本发明得到一种可诱导干细胞软骨分化的双模板分子印迹高强度水凝胶。

主权项

1.一种可诱导干细胞软骨分化的双模板分子印迹高强度水凝胶的制备方法，其特征是包括以下步骤：a)称取0.005‑2g硅酸钠，5‑15g丙烯酰胺，0.5‑2g海藻酸钠，丙烯酰胺质量百分比0.03％‑0.30％的N，N′‑亚甲基双丙烯酰胺，一起溶于50‑100ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液A，然后将纤连蛋白和转化生长因子‑β3溶解于铸膜液A中得到铸膜液B，将铸膜液A和铸膜液B静置消泡后分别放置于无菌容器中备用；b)配制质量百分比为0.5％‑50％的可溶性钙盐水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；c)向步骤a)制备的铸膜液A和铸膜液B中分别加入丙烯酰胺质量百分比0.1％‑5％的过硫酸铵，丙烯酰胺质量百分比0.1％‑5％的亚硫酸氢钠和丙烯酰胺质量百分比0.01％‑2％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将铸膜液A倒入干燥清洁的玻璃板上，用厚度为10‑1000μm的刮膜棒刮成厚度均匀的液膜，然后尽快在该液膜上面倒入铸膜液B，马上用厚度为20‑2000μm的刮膜棒刮平；在N2保护下紫外照射1‑20min引发丙烯酰胺聚合，得到化学交联的凝胶膜；d)将步骤c)得到的化学交联的凝胶膜和玻璃板一起浸泡到步骤b)得到的可溶性钙盐水溶液中，浸泡0.1‑24h，可溶性钙盐与海藻酸钠反应生成海藻酸钙，可溶性钙盐与硅酸钠反应在聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶中原位生成硅酸钙纳米粒子；e)配制质量百分比浓度为0.1％‑10％的葡萄糖酸‑δ‑内酯水溶液，将步骤d)得到的含硅酸钙的凝胶膜浸泡到葡萄糖酸‑δ‑内酯水溶液中0.1‑12h，葡萄糖酸‑δ‑内酯水解释放出氢离子，氢离子与硅酸钙反应，在硅酸钙纳米粒子表面形成介孔硅胶结构，介孔硅胶与海藻酸钙和聚丙烯酰胺发生氢键相互作用，再加上纳米粒子的增强效应，提高了聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶在生理环境下的力学稳定性和抗溶胀性；f)在无菌条件下，将步骤e)得到的水凝胶膜用洗脱溶液洗脱掉纤连蛋白和转化生长因子‑β3，得到纤连蛋白和转化生长因子‑β3双模板分子印迹高强度水凝胶；g)将步骤f)得到的双模板分子印迹高强度水凝胶吸附负载纤连蛋白和转化生长因子‑β3后，得到可诱导干细胞软骨分化的双模板分子印迹高强度水凝胶；通过纤连蛋白构建印迹孔穴和位点吸附更多的纤连蛋白，促进干细胞在水凝胶表面的粘附增殖；通过转化生长因子‑β3构建的印迹孔穴和位点结合更多的转化生长因子‑β3，并实现该生长因子的缓释，保护转化生长因子‑β3的活性并促进干细胞软骨分化。