[发明专利]一种快速构建多价抗体表达载体的方法和试剂

摘要

本申请公开了一种快速构建多价抗体表达载体的方法和试剂。本申请方法包括，用化学合成的两端有酶切位点的抗体基因和连接肽基因组成的插入片段构建载体‑抗体基因‑linker‑1；采用定点突变，构建载体‑抗体基因‑linker‑2和载体‑抗体基因‑3，使三个克隆载体中，前一个克隆载体插入片段3’端酶切的黏末端与后一个载体插入片段5’端酶切的黏末端互补，使三个克隆载体酶切产物能依序相连；采用定点突变将预设的位于多价抗体表达载体两端的酶切位点加入表达载体骨架中，并将多价抗体表达载体接入表达载体骨架。本申请的方法，采用一种核酸内切酶，对所有片段统一进行酶切和连接，即可实现各片段有序连接，获得多价抗体表达载体，大大简化了多价抗体表达载体构建流程。

主权项

1.一种快速构建多价抗体表达载体的方法，其特征在于：包括以下步骤，/n载体-抗体基因-linker-1构建步骤，将化学合成的第一插入片段构建到载体上，所述第一插入片段由5’端至3’端依序包括第一酶切位点、抗体基因片段、连接肽基因片段、第二酶切位点，获得载体-抗体基因-linker-1；/n载体-抗体基因-linker-2构建步骤，以载体-抗体基因-linker-1为模板，采用定点突变技术，将所述第一插入片段5’端的第一酶切位点突变为所述第二酶切位点，将所述第一插入片段3’端的第二酶切位点突变为第三酶切位点，获得载体-抗体基因-linker-2；/n载体-抗体基因-3构建步骤，以载体-抗体基因-linker-1或载体-抗体基因-linker-2为模板，采用定点突变技术，将所述第一插入片段5’端的酶切位点突变为第三酶切位点，并突变去除所述第一插入片段中的连接肽基因片段，同时将所述第一插入片段3’端的酶切位点突变为第四酶切位点，获得载体-抗体基因-3；/n表达载体骨架改造步骤，以表达载体骨架为模板，采用定点突变技术在载体的多克隆位点序列中加入所述第一酶切位点和所述第四酶切位点，获得改造后的表达载体骨架；/n所述第一酶切位点、第二酶切位点、第三酶切位点和第四酶切位点，能够被相同的II型核酸内切酶识别，并产生不同的粘性末端；/n酶切连接步骤，采用所述II型核酸内切酶对载体-抗体基因-linker-1、载体-抗体基因-linker-2、载体-抗体基因-3和改造后的表达载体骨架进行酶切，并采用连接酶进行连接，获得pET28-抗体基因-linker-抗体基因-linker-抗体基因，即所述多价抗体表达载体。/n