[发明专利]一种带有自发性KSHV裂解复制的神经元细胞的构建方法

摘要

本发明公开了一种带有自发性KSHV裂解复制的神经元细胞的构建方法，从Vero219细胞中提取带GFP和RFP荧光标签的rKSHV.219病毒，感染SH‑SY5Y细胞，分选带红色荧光的细胞，采用细胞计数检测细胞增殖情况。提取细胞的DNA、RNA和细胞上清液中的病毒DNA。检测KSHV在细胞和上清液中的KSHV的拷贝数，分析潜伏态的LANA和裂解态的ORF26的mRNA表达水平。冻存细胞一月后复苏，再次检测细胞增殖能力，对新鲜分选的和东存复苏的SK‑RG细胞进行染色，对比eFlour670衰减和感染荧光信号变化的情况。检测细胞增殖能力，检测SK‑RG形成的克隆荧光信号的变化情况。

主权项

1.一种带有自发性KSHV裂解复制的神经元细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、细胞培养SH‑SY5Y神经母细胞瘤细胞、Vero219细胞、HEK293T细胞采用DMEM培养基、10％热灭活胎牛血清FBS、50mg/ml链霉素和50U青霉素培养；其中，Vero219细胞培养基中加入了6μg/ml的嘌呤霉素，用于稳定感染的重组rKSHV.219细胞的筛选；所有细胞在37℃、5％CO2条件下培养；每3天更换一次；细胞计数采用台盼蓝染色法使用Vi‑CELL XR计数仪计数；步骤2、重组rKSHV.219的诱导和滴度测定将Vero219细胞系传代，3.5×106/T75培养瓶接种，培养基20毫升/T75培养瓶；用5ml表达KSHV RTA的杆状病毒Back50感染细胞4小时；除去杆状病毒并加入含有1.25mM丁酸钠的新鲜培养基；30小时后，除去含丁酸盐的培养基，并加入不含嘌呤霉素的新鲜培养基；通过800rpm离心5分钟，收集原始培养基中的细胞并放回锥形瓶中；72小时后，收集含有病毒的上清液，以800rpm离心10分钟，并通过0.45μm过滤器过滤；将澄清滤液中的病毒在4℃下以28000rpm离心2小时；将病毒颗粒重悬于200ml DMEM中，并储存于‑80℃；在rKSHV.219的滴度测定中，将HEK 293T细胞以每孔2.5×104接种到96孔板中，用100μl上清液感染，感染48h后，计数GFP阳性细胞/孔数；感染复数MOI通过计算1ml TCID50产生的GFP阳性细胞的数量来测定；步骤3、KSHV感染SH‑SY5Y细胞用Vero219细胞诱导的rKSHV.219感染SH‑SY5Y细胞，通过HEK 293T细胞测定滴度；以MOI为0.5的KSHV感染SH‑SY5Y，培养2周；将KSHV感染细胞命名为SH‑KSHVr219；rKSHV.219的感染通过荧光显微镜测得原位GFP/RFP得到证实；步骤4、DNA提取和PCR采用Gentra Puregene DNA提取试剂盒，按照说明书，从感染的SH‑SY5Y细胞中提取细胞DNA；扩增ORF26，使用以下循环条件进行:95℃5分钟；35个循环，95℃30s，56℃30s，72℃30s；随后在72℃下进行10分钟的最终延伸步骤；扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色观察；步骤5、上清液KSHV DNA的提取在37℃条件下，首先用脱氧核糖核酸酶处理感染细胞的上清液以除去残留的细胞DNA；然后用苯酚/氯仿从DNA酶处理的KSHV病毒中用乙醇沉淀法提取病毒DNA；步骤6、RNA提取与实时聚合酶链反应采用miRNeasy Mini试剂盒，按照说明书制备总RNA；采用SuperScriptTMIII逆转录试剂盒将1μg量的纯化RNA以20μl体积反向转录合成cDNA的第一链；采用Taqman real‑time PCR和QuantStudio 3实时PCR检测系统进行；循环条件为:50℃，2min；95℃加热10分钟；40个循环95℃15秒，60℃1分钟；结果使用quantstudio 3软件进行评估；对每个引物对的所有样品进行复杂的检查，同时对每个实验进行无模板对照；以pCR 2.1‑ORF26质粒为KSHV的标准品；用10倍的稀释倍数，把质粒从1.48×106拷贝/μl到1.48拷贝/μl做标准曲线进行分析；步骤7、细胞分选为了检测不同细胞的特性，对rKSHV.219感染的细胞进行分选；对rKSHV.219感染的SH‑SY5Y细胞进行胰蛋白酶消化；将细胞重悬于含有1％FBS的PBS中；细胞分选使用BD FACSAria II和BD FACSD iva软件进行；通过使用FSC和SSC门对细胞进行分选以消除碎片，然后通过使用FSC‑H门和FSC‑W门来选择单线态；KSHV感染的SH‑SY5Y细胞首先在此门内使用GFP鉴定；使用GFP和RFP在这些门内识别细胞；还设置分类门以收集GFP+和GFP+/RFP+群体；使用100微米喷嘴在20PSI进行分选；将分选的液滴收集到含有1ml DMEM的15ml Falcon管中；被检测为表达RFP和GFP的细胞群在下文中称为SK‑RG，仅带有GFP的命名为SK‑G；分选后，将细胞转移到6孔培养板上，使细胞生长；步骤8、微滴式数字PCR细胞KSHV DNA拷贝数和LANA和ORF26表达水平分别应用ddPCR Super mix for Probes Kit和One‑Step RT ddPCR Kit for Probes进行检测；用QX100液滴发生器制备20倍滴稀释预扩增产物；然后将液滴分段的样品转移到96孔板中，密封并在ac1000touch热循环仪中循环；DNA聚合酶在94℃，10min，随后进行40循环94℃，30s，55℃，1min，然后在98℃，10min灭酶；mRNA样品分别在30℃，10min、94℃，5min，然后分别在94℃，30s、55℃，30s、55℃，4min进行40次循环，循环后98℃保温10min；使用QX100液滴读取器在FAM和HEX通道上读取完成的扩增反应，并对所得数据进行定量软件分析；步骤9、eFluor 670活细胞染色为了检测SK‑RG细胞培养中能否持续感染细胞，我们用活细胞染色剂eFluor 670染色，流式细胞仪检测细胞；用0.25％胰蛋白酶将SK‑RG和SH‑SY5Y细胞消化成单个细胞，用PBS洗涤2次，除去血清；将细胞重悬浮在PBS中，并与10μM的活细胞染色剂eFluorTM 670在PBS中以1∶1混合，37℃避光孵育10分钟；加入5体积冷完全培养基(含10％血清)停止标记，并在冰上孵育5分钟，用完全培养基洗涤细胞3次，并在培养箱中培养细胞；步骤10、流式细胞检测为鉴定SK‑RG细胞是否能像其他细胞一样冻存复苏，将SK‑RG细胞冻存一个月，随后复苏，同时正常培养未冻存的新鲜细胞，将复苏的细胞命名为SK‑RG‑T；为进一步检测KSHV的感染在细胞是否能够持续，将KSHV感染的SK‑RG细胞和对照细胞用0.25％胰蛋白酶从平板上分离用PBS洗涤；并每3天在BD AccuriTM C6Plus流式细胞仪上对GFP和eFluorTM670阳性细胞以及大小进行测定；使用ACCURI C6PLUS，对数据进行分析；步骤11、软琼脂形成实验为了检测KSHV感染的细胞从单个细胞到多个细胞的状态变化，并检测不同感染的细胞克隆形成能力，将含有0.7％琼脂糖和10％FBS的基层倒入每个60mm板中；琼脂凝固后，将SK‑RG、SK‑G和SH‑SY5Y细胞胰蛋白酶消化，再悬浮于含有10％FBS的DMEM中的4毫升0.35％琼脂糖中；接种后，将平板在37℃、5％CO2温育21天；细胞每3‑4天补充一次营养；实验结束时，用0.2％硝基蓝四唑染色菌落，拍照并计数；每个细胞实验重复三次；步骤12、统计分析使用SPSS 16.0版进行统计分析；数据测量采用独立t检验和方差分析；定量值表示为平均标准差；差异有统计学意义P<0.05。