[发明专利]基于转录组序列开发菊芋SSR分子标记引物的方法

摘要

本发明公开了一种基于转录组序列开发菊芋SSR分子标记引物的方法，涉及分子标记技术领域，该基于转录组序列开发菊芋SSR分子标记引物的方法通过对菊芋品种“青芋1号”的各个器官部位进行转录组测序，利用表达基因的序列数据进行SSR位点的挖掘，对菊芋中SSR的分布及组成特点进行分析，开发SSR引物，并对其在菊芋中的可用性进行初步评价，以期利用SSR标记方法对菊芋种质资源多样性分析、种质资源评价及核心种质资源的发掘奠定基础。

主权项

1.一种基于转录组序列开发菊芋SSR分子标记引物的方法，其特征在于：所述基于转录组序列开发菊芋SSR分子标记引物的方法包括如下步骤：(1)采取花期的根(粗壮根根尖1cm、幼嫩根根尖1cm)、茎(茎基部1cm、茎尖0.5cm)、叶(第一片真叶0.1g、幼嫩叶0.1g)、花(花瓣0.1g、花粉0.1g)和块茎(纵切表皮部0.1g、块茎中央0.1g)提取RNA并等量组成混合样品后，使用HiSeqTM 2500测序仪进行转录组测序，待测序完成采用Trinity进行序列组装，得到63089条Unigene，作为分析背景数据；(2)利用CTAB法提取菊芋资源DNA供检测转录组开发的SSR标记有效性；(3)利用软件MISA对菊芋转录组数据中的Unigene进行搜索，设置搜索标准：最小重复数二核苷酸6次、三核苷酸5次、四核苷酸4次、五核苷酸4次、六核苷酸4次，设置SSR位点间隔最小为100bp；(4)用Primer3软件对SSR重复单元的上下游序列进行引物设计与评价，每条SSR设计3对引物。引物序列长度16‑25bp，预期扩增的片段长度120～300bp，退火温度55～65℃；(5)引物设计过程中避免出现引物二聚体、发卡结构及错配等引物二级结构，从中挑选200对符合用于PCR扩增的引物由华大基因有限公司合成，引物筛选及扩增的PCR反应体系25ul：DNA模板50ng，2×PCR Master Mix(TianGen)12.5ul，上下游引物1ul，ddH2O 9.5ul；(6)扩增产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳2h，银染法显色，以SSR条带的出现频率和SSR的分布距离评价EST‑SSR，SSR出现频率人工读带，对电泳图上可重复的清晰条带记为“1”，对模糊不清或者缺失的条带记为“0”，建立原始数据矩阵，利用软件NTsys 2.10e的UPGMA法进行聚类分析绘图。