[发明专利]一种探究碱老化过程中桑蚕丝素蛋白一级结构变化的方法

摘要

本发明公开的是一种探究碱老化过程中桑蚕丝素蛋白一级结构变化的方法，属于蛋白质结构领域，采用氢氧化钠对桑蚕丝进行老化，碱老化结束以后将PH调节为中性，对溶液进行过滤，透析，冷冻干燥，研磨等操作后，利用研磨所得的粉末进行间接ELISA实验，根据实验结果，得到了桑蚕丝素蛋白的一个特征序列GAGAGSGAGAGS的断裂条件，同时对研究在碱老化过程中，整个蛋白质大分子链结构的变化状况也具有一定意义。

主权项

1.一种探究碱老化过程中桑蚕丝素蛋白一级结构变化的方法，其特征在于包括如下制备步骤：A)取10‑15g桑蚕丝生丝置于烧杯中，加入1000‑1500ml的0.5％Na2CO3溶液，在94‑98℃水浴中加热30min，倒掉烧杯中的溶液，重复进行一次上述操作，然后将烧杯中剩余的桑蚕丝用去离子水冲洗3遍，置于60℃的烘箱中烘干备用；B)取1‑1.5g步骤A)所得的桑蚕丝置于烧杯，剪碎后加入100‑150ml浓度为2.5mol/L的NaOH溶液，在25℃下置于10转/秒的磁力搅拌器上，匀速搅拌1小时后，加入冰醋酸调节PH至7；C)将步骤B)所得的溶液过滤，用分子截留量为8000的透析袋进行透析，每隔4‑6小时换一次水，透析3天后，将透析袋内剩余溶液冷冻干燥并研磨，得到碱老化1小时的桑蚕丝素蛋白粉末；D)重复步骤B)、步骤C)，分别制备获得制备碱老化3小时，6小时，9小时，12小时，24小时的桑蚕丝素蛋白粉末；E)分别取1‑2mg步骤C)和步骤D)所制得的桑蚕丝素蛋白粉末，将其分别放入15ml离心管中,每支离心管加入10mlPH为9.6的碳酸盐缓冲溶液，震荡均匀后得到澄清的包被液；F)取一块96孔酶标板，每孔加入100μl步骤E)中所得包被液，所述酶标板中的每列加五个孔，该五个孔中均加入同一种包被液，列与列之间使用不同的包被液，按照空白对照，阴性对照，阳性对照，碱老化1小时，碱老化3小时，碱老化6小时，碱老化9小时，碱老化12小时，碱老化24小时的顺序完成布板；G)对步骤F)中布置好的96孔板进行间接酶联免疫测试，其具体步骤为：每孔加入200μl的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤3次，然后每孔加入200μl的1wt％的牛血清蛋白溶液，37℃下孵育2h，进行封闭处理；每孔加入200μl的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤3次，然后每孔加入100μl的兔抗丝素蛋白特征多肽一抗，37℃下孵育1h；每孔加入200μl的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤3次，然后每孔加入100μl的HRP标记的山羊抗兔抗体，37℃下孵育1h；每孔加入200μl的pH7.4缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤5次，然后每孔加入50μl的TMB显色的剂A液，再加入50μl的TMB显色剂的B液，摇晃均匀，避光反应10min，然后每孔加入100μl的H2SO4终止反应，测试其在450nm处的吸光度，记为OD450nm。