[发明专利]一种检测细胞培养中支原体感染的新方法

摘要

本发明属于生物检测技术领域，公开了一种检测细胞培养中支原体感染的新方法，取细胞培养液的上清液作为样本；以提取的DNA为模板加入PCR体系，进行扩增反应，得到PCR反应产物；以去核酸水为模板加入PCR体系，进行扩增反应，作为阴性对照；所有扩增反应结束后，同时进行琼脂糖凝胶电泳；观察琼脂糖凝胶电泳检测图；接着进行ELISA反应；确定样品浓度。本发明保证了实验的可靠性和稳定性，比单独设置阳性对照。将PCR技术与ELISA技术相结合，既有PCR技术快速、灵敏的特点，又在特异性鉴定以及量化方面超越了PCR法，使实验结果特异性增强、客观度上更可信，避免了PCR法极易出现假阳性和假阴性结果的弊端。 1

主权项

1.一种检测细胞培养中支原体感染的新方法，其特征在于，所述检测细胞培养中支原体感染的新方法采用细胞悬液和点杂交，将基因组样品点在硝酸纤维素薄膜上，上一抗和二抗，一抗是抗m6A抗体，二抗是抗抗m6A抗体的抗体，二抗有显色效果，根据显色的差异，判断是否有支原体感染；如果信号特别高，有支原体感染。

2.如权利要求1的检测细胞培养中支原体感染的新方法，其特征在于，所述检测细胞培养中支原体感染的新方法包括以下步骤：

步骤一，取培养时间为3‑7天的细胞培养液的上清液作为样本；

步骤二，提取待检细胞的DNA；

步骤三，以提取的DNA为模板加入PCR体系，进行扩增反应，得到PCR反应产物；

步骤四，以去核酸水为模板加入PCR体系，进行扩增反应，作为阴性对照；所有扩增反应结束后，同时进行琼脂糖凝胶电泳；

步骤五，观察琼脂糖凝胶电泳检测图；

步骤六，ELISA反应；对反应产物和不同浓度的标准品分别进行ELISA反应，ELISA反应结束后分别测量PCR反应产物和不同浓度标准品的OD450值；

步骤七，确定样品浓度；

根据不同浓度的标准品的OD450值，绘制OD450值和标准浓度的关系曲线；依照关系曲线，根据PCR反应产物的OD450值，查得PCR反应产物的浓度；根据PCR反应产物的浓度，计算得到待测样品的浓度。

3.如权利要求1的检测细胞培养中支原体感染的新方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳检测图，判定检测结果的方法如下：

1)当特异性扩增CHO细胞甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶DNA序列的引物对相应的扩增产物出现，阴性对照没有出现扩增产物时，说明PCR体系正常工作，此时的PCR检测结果准确可靠；

1.1)此时，如果没有出现特异性扩增支原体16srRNA保守区域DNA序列的引物对相应的扩增产物，说明CHO培养细胞中没有出现支原体感染；

1.2)此时，如果出现了特异性扩增支原体16srRNA保守区域DNA序列的引物对相应的扩增产物，说明CHO培养细胞中出现了支原体感染；

2)如果特异性扩增CHO细胞甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶DNA序列的引物对相应的扩增产物没有出现，说明PCR体系没有正常工作，此时检测结果无效；

3)如果阴性对照出现扩增产物，说明PCR体系受到感染，此时检测结果无效。