[发明专利]一种基于SSR分子标记对新疆厚皮甜瓜“黄皮9818”杂交种纯度高通量鉴定的方法

摘要

本发明公开了一种基于SSR分子标记对新疆厚皮甜瓜“黄皮9818”杂交种纯度高通量鉴定的方法，DNA提取采用碱裂解法，将种子置于96孔PCR板中，加入溶液bufferA，在PCR仪中95℃热浴10分钟，然后加入bufferB混匀，即可用于PCR扩增。利用双亲筛选多态性SSR引物，利用F1进行验证，共筛选出8对双亲互补型引物。按照PCR扩增产物片段大小进行排序和组合，可以分别PCR扩增，将PCR产物混合，在一板聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后读取条带，进行杂交种纯度鉴定。与田间杂交种纯度传统鉴定结果基本吻合。本发明可高通量快速准确鉴定甜瓜黄皮9818杂交种纯度，且成本低廉，应用前景广阔。

主权项

1.一种基于SSR分子标记对新疆厚皮甜瓜“黄皮9818”杂交种纯度高通量鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.DNA提取：采用碱裂解法，将种子在30℃培养箱中保湿催芽48小时，取2cm下胚轴置于96孔PCR板中，加入50uL bufferA溶液，bufferA溶液的成分为100mM NaOH+2％Tween20，盖上硅胶盖置于PCR仪中95℃热浴10分钟，打开硅胶盖，加入50uL bufferB溶液，bufferB溶液的成分为100mM Tris‑HCl+2mM EDTA，盖上硅胶盖上下颠倒10次混匀，置于BE‑6100微孔板迷你离心机中瞬时离心，上清液用于PCR扩增；步骤2.PCR扩增：PCR单管反应总体系为10uL，2*EasyTaq PCR SuperMix for PAGE 5uL，Forward Primer和Reverse Primer各0.25uL，ddH2O 3.5uL，DNA模板1uL；取3个1.5mL离心管置于离心管板上，分别编号为1、2、3、4、5、6和7，每管加入350uL ddH2O，再分别加入2*EasyTaq PCR SuperMix for PAGE 500uL，向管1中加入CMTTCN273和ECM206正向引物和反向引物各12.5uL；向管2中加入CMBR007正向引物和反向引物各25uL；向管3中加入CMAGAN268正向引物和反向引物各25uL，向管4中加入CMBR064正向引物和反向引物各25uL，向管5中加入CMBR109正向引物和反向引物各25uL，向管6中加入ECM78正向引物和反向引物各25uL，向管7中加入ECM91正向引物和反向引物各25uL；将7个离心管上下颠倒5次，瞬时离心备用；取7个96孔板分别编号1、2、3、4、5、6和7；向1号96孔板第一列每一孔分别加入112uL1号离心管中混合物，然后利用8道effendorf移液器分装至剩余11列每孔中，每孔9uL；同1号96孔板操作类似，将2号离心管至7号离心管中混合物分装至2号至7号96孔板中，每孔9uL；利用8道effendorf移液器吸取1uL样品DNA加入到7个96孔板的对应孔中；PCR反应程序为94℃预变性5min；27个扩增循环，94℃30s，57℃30s，72℃1min；72℃延伸7min，4℃保存；引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:16所示；步骤3.PCR扩增产物的混合：SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:8所示的引物组合：利用8道effendorf移液器分别取步骤2中CMTTCN273和ECM206双重PCR产物4uL，CMBR007引物PCR产物3uL和CMAGAN268引物PCR产物6uL，置于一个新的96孔板中，同一待检测样品不同引物PCR扩增产物混为一个样品，利用BE‑6100微孔板迷你离心机中瞬时离心混匀；SEQ ID NO:9‑SEQ ID NO:12所示的引物组合：利用8道effendorf移液器分别取CMBR064和CMBR109两对引物的PCR扩增产物各3uL，置于一个新的96孔板中，同一待检测样品不同引物PCR扩增产物混为一个样品，利用BE‑6100微孔板迷你离心机中瞬时离心混匀；SEQ ID NO:13‑SEQ ID NO:16所示的引物组合：利用8道effendorf移液器分别取ECM78和ECM91两对引物的PCR扩增产物各3uL，置于一个新的96孔板中，同一待检测样品不同引物PCR扩增产物混为一个样品，利用BE‑6100微孔板迷你离心机中瞬时离心混匀；步骤4.PCR扩增产物的检测：将步骤3中混合后样品，每孔取6uL经8％的非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分离，电泳缓冲液为1*TBE，电压170V，电泳60min；电泳结束后采用银染法染色；将凝胶剥离出来置于固定液中，固定液的成分为100mL无水乙醇+5mL冰醋酸+895mL去离子水，摇床震荡10min；去离子水冲洗一遍，置于染色液中，染色液的成分为3g AgNO3+1L去离子水，摇床震荡10min；去离子水冲洗一遍，置于显影液中，显影液的成分为13g NaOH+995mL去离子水+5mL甲醛，摇床震荡至凝胶变黄，条带显现后即倒掉显影液，加入去离子水清洗一遍，立即照相并统计带型；将检测样品与“黄皮9818”双亲带型进行比较，表现为双亲互补型的是“黄皮9818”杂交种；仅有亲本带型的为非杂交种；出现其它带型的为外来杂种子；步骤5.杂交种纯度的计算：利用步骤4中的统计结果计算送检“黄皮9818”品种杂交种纯度，送检样品“黄皮9818”品种杂交种纯度(％)＝(总检测种子粒数‑非杂交种数‑外来杂种子数)/总检测种子数*100％。